T细胞的分类
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T细胞分选是相关研究中的关键环节，在磁珠分选实验中有很多不可忽视的关键点，直接影响着分选实验的得率和纯度。本文将详细解析美天旎磁珠分选实验前后的关键注意事项，并深入解读四款热门T细胞磁珠分选实验流程（CD3、CD4、CD8、Treg细胞），涵盖人源和鼠源样本，涉及阳性分选，阴性分选及顺序分选策略。助您一站式掌握T细胞磁珠分选核心技术！
关于磁珠分选实验，您务必要知道的关键点（耐心看完，后附分选实操案例）
分选前准备
❖ 确认磁珠
根据您的实验种属、样本来源、目的细胞marker选择适配的磁珠。
❖ 确认分选策略
根据您实验的指标类型以及后续需求选择对应的分选策略。
阳性分选
目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。该方法常用于以下情况：
1.分选表达单一表面标志物的细胞分选（如CD3+,CD4+,CD8+细胞）
2.稀有细胞的分选(如循环肿瘤细胞CTC、肿瘤浸润淋巴细胞TIL)
3.表达较弱的表面标志物细胞分选（如CD133+细胞）
4.去除特定细胞群分选（如TCRαβ+T去除、CD45RA+细胞去除）
阴性分选/去除分选
非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。该方法常用于以下情况：
1.去除特定非目的细胞群
2.缺乏目的细胞特异性表面标志物的分选（如某些肿瘤细胞、神经元）
3.磁珠分选后需进一步通过阳性选择分选细胞亚群（CD4+CD25+Treg）
4.分选后的细胞表面不可带有任何磁珠标记
顺序分选
联合使用两种分选策略，例如先阴选后阳选，或先使用可剪切的REAlease磁珠后进行阳性分选。该方法常用于以下情况：
1.同步分离两种特定细胞亚群：首先通过阴性分选去除共同杂质细胞，随后利用阳性分选将剩余的目标细胞亚群分开
2.目标抗原在非目的细胞上存在交叉表达，导致直接阳性分选纯度不足
3.要分选极稀有的细胞，通过预富集步骤提高目的细胞的纯度和得率
❖ 确认分选柱
对于不同类型的分选柱选择，关键是不要超过推荐的细胞量，否则会使柱子过载，导致分选效果不佳。可根据您的细胞总数和目标细胞数、分选策略选择对应的分选柱，可参考下图。对于具体使用的磁珠，参考每个磁珠说明书附的数据表，进行分选柱的选择。
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相关产品货号：
| 货号 | 名称 | 规格 | 总细胞上限数目 | 标记细胞上限数目 |
| 130-042-201 | MS Columns 国内现货 | 25根/盒 | 2x108 | 107 |
| 130-122-727 | MS Columns plus tubes | 25根+75支 | ||
| 130-042-401 | LS Columns 国内现货 | 25根/盒 | 2x109 | 108 |
| 130-122-729 | LS Columns plus tubes | 25根+75支 | ||
| 130-042-901 | LD Columns 国内现货 | 25根 | 5x108 | 108 |
❖ 确认分选平台
根据您的分选柱，选择适配的分选平台。
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相关产品货号：
| 货号 | 分选柱 | 分选套装名称 | 通道 | 分选套装名称 |
| 130-090-312 | MS | MiniMACs Starting kit 国内现货 | 单通道 | 阳性分选 |
| 130-042-108 | OctoMACS Starting Kit | 多通道 | ||
| 130-042-301 | LS/LD | MidiMACs Starting kit 国内现货 | 单通道 | 阳性分选、阴性分选 |
| 130-091-051 | QuadroMACs Starting kit | 多通道 | ||
| 130-042-501 | MS/LS.LD | Mini&midiMAcs Starting kit | 单通道*2 | 阳性分选、阴性分选 |
❖ 准备分选缓冲液
方案1：将MACSBSAStockSolution（#130‑091‑376）和autoMACSRinsingSolution（#130‑091‑222）按照1:20配置，作为分选buffer；分选缓冲液需放置4°预冷。
方案2：如您的细胞对于叠氮化钠成分不敏感，可直接选择autoMACSRunningBuffer（#130-091-221）进行分选。该buffer内含有少量的叠氮化钠，对某些敏感细胞，例如神经细胞造成影响。
方案3：含0.5%BSA、2mMEDTA的PBS，配置后调整PH至7.2，需去除气泡，气泡可能导致分选柱堵塞。配好的buffer可先静置，也可使用真空抽滤、超声消除气泡。
❖ 细胞计数和活性检测
分选前需要检测单细胞样本的细胞量及细胞活率，通过细胞量计算您的磁珠添加量；建议起始单细胞活率达到85%以上再进行磁珠分选，会得到较为理想的实验结果。
您可以选择对应产品提升样本的初始活性：
细胞筛网（MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462）、
碎片去除试剂（DebrisRemovalSolution#130-109-398 ）、
死细胞去除磁珠（ DeadCellRemovalKit #130-090-101）、
裂红试剂（RedBloodCellLysisSolution(10×)#130-094-183）。
分选过程中
一 磁珠篇
❖ 美天旎磁珠为胶体溶液，不会沉淀，实验前不用摇晃即可直接使用。
❖ 磁珠说明书中推荐的磁珠标记的体积适用于1×107的细胞。当您的总细胞量少于107细胞，需按照说明使用相同的体积。当超过107细胞数，将所有试剂体积和总体积按照相应比例增加。
❖ 磁珠孵育温度为2-8℃，建议在冰箱中避光孵育，直接放置于冰上会使磁珠结合效率变差。提高温度或延长孵育时间均可能导致非特异性磁性标记。
二 分选篇
❖ 分选柱在加样前需使用缓冲液润洗，润洗分选柱的缓冲液请事先回温至操作环境温度，防止预冷的缓冲液润洗室温分选柱，导致分选柱中形成小气泡，使分选效果不佳。
❖ 整个分选过程要尽量快速操作，保持细胞处于低温，分选过程中使用的分选缓冲液需预冷，可防止抗体包裹在细胞表面以及非特异性的磁性标记。
❖ 每一次向分选柱中加液均需等到分选柱中的液体流空，最后一滴在分选柱中不滴出时，再进行下一步加液。
❖ 收集分选柱中磁珠标记的细胞液，需要将分选柱从磁场中拿下，放至收集管上，向分选柱加入缓冲液后立即进行栓塞按压；分选柱栓塞只能按压一次，请勿反复操作。
❖ 分选柱为一次性耗材，请勿重复使用。
分选结束后
❖ 利用流式检测目的细胞占比及分选后细胞活性，计算出分选纯度和分选得率，您可参考以下公式进行计算：
· 分选纯度=分选后目的细胞总数量/分选后所得所有细胞总数量
· 分选得率=分选后目的细胞总数量/分选前目的细胞总数量
注意：分选前目的细胞总数量=标记后未上柱子前的细胞悬液*目的细胞占比
为您详细解读4个热门T细胞分选实例，干货来袭，照搬流程直接做实验！
Pan T细胞分选： PanTCellIsolationKitII, mouse
CD4+T细胞分选：CD4MicroBeads, human
CD8+T细胞分选：CD8a+TCellIsolationKitII, mouse
Treg细胞分选：CD4CD25RegulatoryTCellIsolationKit
Pan T细胞分选：鼠源PanT细胞分选试剂盒（#130-095-130）
磁性分选耗材
❖ LS分选柱（#130-042-401）
❖ MidiMACS分选器（#130-042-302）（适用于LS分选柱）
❖ MACSMultiStand（#130-042-303）
❖ MACSBSAStockSolution（#130-091-376）和autoMACSRinsingSolution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-SeparationFilters30μm预分离滤器（#130-041-407）（可选，磁珠标记前去除细胞团，防止堵塞分选柱）
实验步骤
一 磁珠标记非CD3+细胞
1. 细胞计数；
2. 细胞悬液300×g离心10分钟，弃上清；
3. 细胞重悬，每1×107细胞添加40μL分选缓冲液；
4. 每1×107细胞添加10μLBiotin-AntibodyCocktail抗体；
5. 混匀，于2-8℃孵育5min；
6. 每1×107细胞添加30μL分选缓冲液；
7. 每1×107细胞添加20μLAnti-BiotinMicroBeads磁珠；
8. 混匀，于2-8℃孵育10min；
9. 添加分选缓冲液，调整溶液体积至500μL（注：500μL体积最大重悬至1×108细胞，对于更多的细胞数量，需要相应提高缓冲液体积）
二 磁珠去除非CD3+细胞
1. 将LS分选柱放入MidiMACS分选器的磁场中。
2. 用3mL分选缓冲液润洗分选柱，等到分选柱排空后再进行下一步骤；
3. 将制备好的细胞悬液加入到分选柱中；
4. 收集通过的未被标记的细胞；
5. 用3mL分选缓冲液冲洗分选柱，收集通过的未标记的细胞，即为富集的T细胞；
6.（可选）如需非T细胞，可取出分选柱，将其放至收集管上。吸取5mL缓冲液到分选柱中，立即将栓塞推入分选柱中，冲洗出磁珠标记的非T细胞。
CD4细胞分选：人源CD4+T细胞分选试剂盒（#130-045-101）
磁性分选耗材
❖ MS分选柱（#130-042-201）或LS分选柱（#130-042-401）
❖ MiniMACS分选器（#130-042-102）或MidiMACS分选器（#130-042-302）
❖ MACSMultiStand（#130-042-303）
❖ MACSBSAStockSolution（#130-091-376）和autoMACSRinsingSolution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-SeparationFilters30μm预分离滤器（#130-041-407）（可选，磁珠标记前去除细胞团，防止堵塞分选柱）
❖ 如需进行去除分选，需选择LD分选柱，搭配MidiMACS分选器
实验步骤
一 磁珠标记CD4+细胞
1.细胞计数；
2.细胞悬液300×g离心10分钟，弃上清；
3.细胞重悬，每1×10⁷细胞加80μL分选缓冲液；
4.每1×10⁷细胞添加20μLCD4MicroBeads, human磁珠；
5.混匀，于2-8℃孵育15min；
6.每1×10⁷个细胞加入1-2mL分选缓冲液洗涤细胞，300×g离心10分钟，弃上清；
7.添加分选缓冲液，调整溶液体积至500μL（注：500μL体积最大重悬至1×108细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。
注：如用LD分选柱去除细胞时，每1.25x108个总细胞用500μL缓冲液重悬。
二 磁珠分离CD4+细胞
1.将分选柱放入对应的MACS分选器的磁场中；
2.用适量缓冲液润洗分选柱，等到分选柱中液体排空后，再进行下一步骤（MS分选柱使用500μL分选缓冲液润洗；LS分选柱使用3mL分选缓冲液润洗）；
3.将制备好的细胞悬液加入分选柱中，收集的流穿细胞液为未被标记的CD4-细胞；
4.分别用分选缓冲液清洗柱子三次（MS分选柱使用500μL分选缓冲液清洗3次；LS分选柱使用3mL分选缓冲液清洗3次），收集未被标记上的CD4-细胞；
5.从分选器中取出分选柱，将其放到合适的收集管上；
6.吸取适量的缓冲液（MS：1mL；LS：5mL），加到分选柱中，立即将栓塞推入分选柱中，冲洗出磁珠标记的细胞，即为CD4+T细胞；
7.（可选）为了提高CD4+细胞的纯度，冲洗出的细胞可用MS或LS分选柱再次富集。用新的分选柱按照第1-6步重复磁珠分选步骤即可。
用LD（130-042-901）分选柱去除分选
1.将LD分选柱放入MidiMACS分选器的磁场中；
2.用2mL缓冲液湿润分选柱；
3.将制备好的细胞悬液加到分选柱中；
4.收集流出来的细胞，再用1mL缓冲液冲洗分选柱两次，收集流出来的液体即为未被磁珠标记的CD4-细胞。
CD8细胞分选：鼠源CD8a+T细胞分选试剂盒（#130-104-075）
磁性分选耗材
❖ LS分选柱（#130-042-401）
❖ MidiMACS分选器（#130-042-302）（适用于LS分选柱）
❖ MACSMultiStand（#130-042-303）
❖ MACSBSAStockSolution（#130-091-376）和autoMACSRinsingSolution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-SeparationFilters30μm预分离滤器（#130-041-407）（可选，磁珠标记前去除细胞团，防止堵塞分选柱）
实验步骤
一 磁珠标记非CD8+细胞
1. 细胞计数；
2. 细胞悬液300×g离心10分钟，弃上清；
3. 细胞重悬，每1×107细胞添加40μL分选缓冲液；
4. 每1×107细胞添加10μLBiotin-AntibodyCocktail抗体；
5. 混匀，于2-8℃孵育5min；
6. 每1×107细胞添加30μL分选缓冲液；
7. 每1×107细胞添加20μLAnti-BiotinMicroBeads；
8. 混匀，于2-8℃孵育10min；
9. 添加分离缓冲液，调整溶液体积至500μL（注：500μL体积最大重悬至1×108细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。
二 磁珠去除非CD8+细胞
1. 将LS分选柱放入MidiMACS分选器的磁场中；
2. 用3mL分离缓冲液润洗分选柱，等到分选柱排空后再进行下一步骤；
3. 将制备好的细胞悬液加入到分选柱中，收集通过的未标记的细胞；
4. 用3mL分离缓冲液冲洗分选柱，收集的流穿细胞液即为富集的CD8+T细胞；
5.（可选）如需非CD8细胞，可取出分选柱，将其放至收集管上，吸取5mL缓冲液到分选柱中，立即将栓塞推入分选柱中，冲洗出磁珠标记的非CD8细胞。
Treg细胞分选：人源CD4+CD25+Treg细胞分选试剂盒（#130-091-301）
磁性分选耗材
❖ LD分选柱（#130-042-901）
❖ MS分选柱*2（#130-042-201）
❖ MiniMACS分选器（#130-042-102）（适用于MS分选柱）
❖ MidiMACS分选器（#130-042-302）（适用于LD分选柱）
❖ MACSMultiStand（#130-042-303）
❖ MACSBSAStockSolution（#130-091-376）和autoMACSRinsingSolution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-SeparationFilters30μm预分离滤器（#130-041-407）（可选，磁珠标记前去除细胞团，防止堵塞分选柱）
实验步骤
一 磁珠标记非CD4+细胞
1.细胞计数；
2.细胞悬液300×g离心10min，弃上清；
3.细胞重悬，每1×10⁷细胞加90μL分选缓冲液；
4.每1×10⁷细胞添加10μLCD4+TCellBiotin-AntibodyCocktail抗体；
5.混匀，于2-8℃孵育5min；
6.每1×10⁷个细胞加入20μLAnti-BiotinMicroBeads磁珠；
7.混匀，于2-8℃孵育10min；
8.添加分离缓冲液，调整溶液体积至500μL（注：500μL体积最大重悬至1×108细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。
二 磁珠去除非CD4+细胞
Treg细胞分离第一步是去除非CD4+细胞，使用LD分选柱
1.将LD分选柱放入MidiMACS分选器的磁场中；
2.用2ml分选缓冲液进行分选柱润洗，等到分选柱中液体排空后再进行下一步骤；
3.将制备好的细胞悬液加入分选柱中，收集通过的未标记的细胞；
4.分别用1ml分选缓冲液清洗柱子两次，收集的流穿细胞液可用于进一步分离Treg和Tresp细胞所需的未标记的预富集的CD4+细胞组分；
5.细胞计数。
三 磁珠标记CD25+细胞
1.细胞悬液300×g离心10min，弃上清；
2.细胞重悬，每1×10⁷细胞加90μL分选缓冲液；
3.每1×10⁷细胞添加10μLCD25MicroBeads磁珠；
4.混匀，于2-8℃孵育15min；
5.每1×10⁷个细胞加入1-2mL分选缓冲液洗涤细胞，300×g离心10分钟，弃上清；
6.添加分离缓冲液，调整溶液体积至500μL（注：500μL体积最大重悬至1×108细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。
四 磁珠分选CD25+细胞
Treg分选的第二步是阳性分选CD25+细胞。该步骤中，依次使用两个MS分选柱（1×10⁷标记细胞容量）为了不超过容量限制，建议先通过流式细胞术测定细胞悬液中CD25+的细胞浓度。
1.将MS分选柱放入MiniMACS分选器的磁场中；
2.用500μL分选缓冲液润洗分选柱，等到分选柱中液体排空后再进行下一步骤；
3.将制备好的细胞悬液加入分选柱中，收集通过的未标记的细胞；
4.分别用500μL分选缓冲液清洗柱子三次，收集的流穿细胞液即为Tresp细胞(CD4+CD25-)的细胞液；
5.将分选柱从分选器上取出，置于合适的收集管上，添加1ml分选缓冲液到柱子中，立即将栓赛推入柱中，冲洗出磁性标记细胞；
6.为了提高CD4+CD25+细胞浓度，洗脱的部分可以在第二个MS分选柱上富集。使用新的MS分选柱重复步骤1-6中所述的磁分选步骤。分离得到的Treg和Tresp细胞可以用于体外抑制分析。
以上就是四款热门T细胞磁珠分选的实验流程！想了解更多T细胞磁珠产品，小优为您总结了T细胞分选产品合集：
Pan T细胞分选：
去除分选：货号130-096-535 PanTCellIsolationKit, human
阳性分选：货号130-050-101 CD3MicroBeads, human
阳性分选：货号130-136-769 CD3MicroBeadsUltraPure, human
去除分选：货号130-095-130 PanTCellIsolationKitII, mouse
阳性分选：货号130-094-973 CD3eMicroBeadKit, mouse
去除分选：货号130-095-130 PanTCellIsolationKit,rat
CD4+T细胞分选：
去除分选：货号 130-096-533 CD4+TCellIsolationKit, human
阳性分选：货号 130-045-101 CD4MicroBeads, human
去除分选：货号 130-104-454 CD4+TCellIsolationKit, mouse
CD8+T细胞分选：
去除分选：货号130-096-495 CD8+TCellIsolationKit, human
阳性分选：货号130-045-201 CD8MicroBeads, human
去除分选：货号130-104-075 CD8a+TCellIsolationKitII, mouse
去除分选：货号130-093-244 NaïveCD8+TCellIsolationKit, human
Treg细胞分选：
货号130-091-301 CD4+CD25+RegulatoryTCellIsolationKit, human
货号130-094-775 CD4+CD25+CD127dim/RegulatoryTCellIsolationKitII, human
货号130-093-631 CD4+CD25+CD45RA+RegulatoryTCellIsolationKit, human
货号130-094-551 CD25+CD49d-RegulatoryTCellIsolationKit, human
货号130-092-984 CD4+CD25+RegulatoryTCellIsolationKit, non-humanprimate
货号130-091-041 CD4+CD25+RegulatoryTCellIsolationKit, mouse
Tcr g/d细胞分选：
去除分选：货号130-092-892 TCRg/d+TCellIsolationKit, human
阳性分选：货号130-050-701 Anti-TCRg/dMicroBeadKit, human
去除分选：货号130-092-125 TCRg/d+TCellIsolationKit, mouse
NKT细胞分选：
去除分选：货号130-093-064 CD3+CD56+NKTCellIsolationKit, human
阳性分选：货号130-094-842 Anti-iNKTMicroBeads, human
美天旎针对肿瘤组织样本的T细胞提取有专门的分选产品供您选择：
T细胞分选(肿瘤组织)：
货号130-116-475 CD4(TIL) MicroBeads, mouse-
货号130-116-478 CD8(TIL) MicroBeads, mouse
货号130-116-480 CD4/CD8(TIL)MicroBeads, mouse
货号130-121-562 REAleaseCD3(TlL) MicroBeadKit, human
货号130-121-559 REAleaseCD4(TlL) MicroBeadKit, human
货号130-121-560 REAleaseCD8(TlL) MicroBeadKit, human