一、实验思路框架
| 样本来源类型 | 外周血PBMC（新鲜&冻存） |
| 检测指标 | 31个 |
| 流式仪器型号 | Cytek Aurora |
| 靶标细胞亚群 | CD8⁺/CD4⁺ T细胞、γδT细胞、NKT样细胞、NK细胞、Treg细胞、Th1/Th2/Th17/Th9/22细胞、耗竭/活化T细胞 |
二、配色方案
| Marker | Clone | Fluorochrome | Laser (nm) | Purpose |
| Viability | N/A | Live/Dead Blue | 405 | 排除死细胞 |
| CD45 | 2D1 | Spark Blue 550 | 405 | 谱系标记（淋巴细胞圈门） |
| CD3 | SK7 | BV510 | 405 | 总T细胞标记 |
| CD4 | SK3 | NovaFluor Blue 610-70 | 405 | CD4+ T细胞亚群 |
| CD8 | SK1 | BUV805 | 355 | CD8+ T细胞亚群 |
| TCRγδ | B1.1 | PE-Fire 700 | 561 | γδ T细胞标记 |
| CCR7 | G043H7 | BV650 | 405 | 记忆/初始T细胞分群 |
| CD127 (IL-7Rα) | A019D5 | AF700 | 640 | T及效应T细胞标记 |
| CD25 | BC96 | BV605 | 405 | T激活标记 |
| CD27 | M-T271 | Pacific Blue | 405 | T细胞分化状态（初始/记忆） |
| CD28 | CD28.2 | BV750 | 405 | 共刺激分子（T细胞功能） |
| CD45RA | 5H9 | BUV395 | 355 | 初始T细胞标记 |
| CD45RO | UCHL1 | PerCP | 488 | 记忆T细胞标记 |
| CD73 | AD2 | BUV661 | 355 | T抑制功能（TR1样） |
| CD95 (Fas) | DX2 | PE-Fire 640 | 561 | 凋亡/激活标记 |
| Foxp3 | PCH101 | AF660 | 640 | T特异性转录因子 |
| KLRG1 | SA231A2 | APC | 640 | 终末分化T细胞标记 |
| CD38 | S17015F | Spark YG 581 | 561 | 激活/增殖标记 |
| CD39 | A1 | BV785 | 405 | 免疫抑制（T功能） |
| CD56 (NCAM) | NCAM16.2 | BUV737 | 355 | NK/T细胞激活标记 |
| HLA-DR | L243 | APC-Fire 810 | 640 | APC激活标志 |
| CD49d | L25 | BUV563 | 355 | 黏附/迁移标记（抗原经历） |
| CD11a (LFA-1) | H1111 | BUV496 | 355 | 激活/抗原经历标记 |
| CD226 (DNAM-1) | 11A8 | BV421 | 405 | 效应功能（NK/T细胞杀伤） |
| Granzyme B | QA16A02 | APC-Fire 750 | 640 | 细胞毒性功能（CD8+/CD4 CTL） |
| CCR4 | 1G1 | BUV615 | 355 | Th2/T迁移标记 |
| CCR6 | G034E3 | BV711 | 405 | Th17细胞迁移标记 |
| CXCR3 | G025H7 | PE-Dazzle 594 | 561 | Th1细胞迁移标记 |
| CXCR5 | RF8B2 | BB700 | 488 | T标记 |
| PD-1 | NAT105 | PE | 561 | 耗竭标志（T细胞功能障碍） |
| TIM-3 | 7D3 | BB515 | 488 | 耗竭/免疫调节标志 |
三、圈门逻辑
1、初始圈门：
排除双联体（FSC-A/FSC-H） → 活细胞（Live/Dead Blue-） → 淋巴细胞（FSC/SSC） → CD45+细胞
2、T细胞亚群分层：
总T细胞：CD3+ → 分为CD4+、CD8+、TCRγδ+
记忆/初始亚群：基于CCR7/CD45RA/CD45RO/CD95（如Naïve: CCR7+CD45RA+CD95-）
3、功能亚群
Treg：CD25+Foxp3+CD127low → 进一步分记忆/初始（CD45RA/RO）
TFH：CXCR5+PD-1+（来自CD4+Foxp3-群体）
Th1/Th2/Th17：CXCR3/CCR4/CCR6组合
4、激活/耗竭分析：
激活标志（HLA-DR+CD38+）和耗竭标志（PD-1+TIM-3+）在CD4/CD8亚群中的表达
5、高维验证：使用t-SNE和FlowSOM聚类分析，与手动圈门结果比对，确保亚群表型一致性
四、流式结果图
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参考文章
31-color spectral flow cytometry panel to investigate the steady-state phenotype of human T cells
