一、实验思路框架
| 样本来源类型 | 健康供体新鲜外周血 |
| 检测指标 | 42色 |
| 流式仪器型号 | ID7000™光谱细胞分析仪（配置5激光器） |
| 靶标细胞亚群 | T细胞亚群（Treg、Th1/Th2/Th17、MAIT、γδT、iNKT） B细胞亚群（Naive、记忆B、浆母细胞 DC（cDC1/cDC2/pDC）、NK细胞（早期/成熟/终末） 单核细胞亚群、造血祖细胞（cHPC） ILC1-3等 |
二、配色方案
| Specificity | Fluorochrome | Clone | Purpose |
| Beta7 | BV421 | FIB504 | Homing receptor |
| CD103 | BUV737 | Ber-ACT8 | Resident cells |
| CD11b | APC-Fire810 | M1/70 | Granulocytes |
| CD11c | PE-Cy7 | Bu15 | Dendritic cells |
| CD123 | BUV615 | 6H6 | Basophils and plasmacytoid dendritic cells |
| CD127 | BV570 | A019D5 | LCs and T cll subsets |
| CD14 | Spark Violet 538 | S18004B | Monocytes |
| CD141 | PE-Dazzle 594 | M80 | Dendritic cell differentiation |
| CD16 | PerCP-Cy5.5 | 3G8 | Neutrophils Monocyte and NK cell differentiation |
| CD161 | eFluor450 | HP3G10 | NK cells,NKT cells,MAIT cellsandLCs |
| CD183(CXCR3) | BUV395 | CXCR3/1C6 | Chemokine receptor;T cell and B cell subsets |
| CD185(CXCR5) | BV480 | RF8B2 | Chemokine receptor;T cell and B cell subsets |
| CD19 | PE-Fire640 | HIB19 | B cells |
| CD194(CCR4) | PE-Fire810 | L291H4 | Chemokine receptor;T cell subsets |
| CD196(CCR6) | BUV563 | 11A9 | Chemokine receptor;T cell and B cell subsets |
| CD197(CCR7) | Spark NIR685 | G043H7 | Chemokine receptor;T cell subset |
| CDle | NovaFluor Yellow730 | L161 | Dandritie cell differentiation |
| CD24 | BUV805 | ML5 | B cell subsetand granlocytes |
| CD25 | BV605 | M-A251 | RegulatoryT cells |
| Activation marker;T cells | |||
| CD27 | FITC | 0323 | Tcell andB cell subset |
| CD278(ICOS) | PE-Cy5 | C398.4A | T cell co-stimmulatory receptor |
| CD279(PD-1) | BV785 | EHl22H7 | Tcell inhibitoryreceptor |
| CD28 | BUV496 | CD28.2 | T cell subsets |
| CD294(CRTHD) | BV750 | BM16 | Basophils andILCs |
| CD3 | SparkBlue550 | SK7 | T cells |
| CD38 | BV650 | HB-7 | B cell subsets |
| CD4 | PerCP-Fire806 | SK3 | HelperTcells,NKT ell,and MAIT cells |
| CD45 | Spark Blue 574 | 2DI | Pan leukoeytes |
| CD45RA | PE-Fire700 | H100 | T cell subsets |
| CD56 | RY586 | MY31 | NK cells,NKTcells,and ILCs |
| CD8 | PerCP | SK1 | Cytotcoxie T cells,NKcels,NKTell,and MAITells |
| CD69 | RB780 | FN50 | Activationmarker,T cells,B cells,NKcells,and granlocytes |
| HLA-DR | NovaFluor Blue 660 | LNB | Dandritic cells,monoeytes,B cells,andT call activation |
| IgA | PE | IS11-8E10 | B cell subsets |
| IgD | APC | IA6-2 | B call subsets |
| IgG | BUV661 | G18-145 | B cell subsets |
| IgM | AF700 | MHM-88 | B cell subsets |
| TCRVu72 | APC | 3C10 | MAIT cells |
| TCRγō | PerCP-eFluor 710 | B1.1 | yōT cells |
| TIGIT | BV711 | A15153G | T ell and NKcell subsets |
| Live/Dead | Zcmbie-NIR | 一 | Cell viability |
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三、圈门逻辑
1、活的白细胞（Live CD45+）
首先使用time图圈出液流稳定区域，通过死活染料和CD45圈出活的白细胞，再利用FSC-A/H去除细胞粘连，通过SSC-A区分粒细胞、淋巴细胞和单核细胞群体，进行进一步的分析。
2、粒细胞（Granulocytes）
CD19/SSC-A圈出粒细胞，在粒细胞门中进一步区分嗜酸性粒细胞 （CD11b+CD16−） 与中性粒细胞 （CD11b+CD16+）
谱系细胞lineage-（Basophils、DCs & ILCs）所示，嗜碱性粒细胞通过CD123和CD294的表达以及谱系标志物和HLA-DR的缺乏来鉴定，同时圈出低密度粒细胞（CD11b+CD16+）
3、B细胞（B cells）
CD19/SSC-A圈出B细胞后，通过CD24、CD27、CD38、IgA、IgG、IgD和IgM等标记物，区分B细胞的成熟阶段，包括幼稚B细胞 naïve B cells (IgD+IgM+CD24+/− CD27−CD38+/−),未转换记忆B细胞unswitched memory B cells( IgDloIgM++CD24+/-CD27+CD38+/−)、只保留IgD的未转换记忆B细胞IgD-only switched memory B cells (IgD+IgM−CD24+/-CD27+CD38+/−), 转换型记忆B细胞switched memory B cells (IgA+/IgG+CD24+/-CD27+CD38+/−)、未成熟的B细胞transitional B cells (CD24++CD27−CD38++) 和浆母细胞 plasmablasts (CD24−CD27+CD38++)
4、NK细胞（NK cells）
CD3-CD56+圈出NK细胞群，将NK细胞的分成NKdim （CD56+CD16+）和NKbright（CD56++CD16−）两个亚群。并且用TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）和CD161表达标记了其他的亚群。此外，CD56也被用作NKT细胞的标志物。
5、单核细胞（Monocytes
CD45/SSC-A圈出单核细胞，采用CD14和CD16来区分非经典单核细胞（CD14dimCD16+），经典单核细胞（CD14++CD16-）以及中间型单核细胞（CD14+CD16+）
6-7、谱系细胞 lineage-（Basophils、DCs & ILCs）
常规DC（cDCs）通过CD11c和HLA-DR进行鉴定，并用CD141和CD1c进行亚分类。分别标记了传统树突状细胞cDC（cDC1：CD141+，cDC2：CD1c+）、浆细胞样树突状细胞pDC（CD123+HLA-DR+）、嗜碱性粒细胞（CD123+HLA−DR-）、固有淋巴细胞ILCs（ILC1/3：CD127+，ILC2：CD127+CD294+）和低密度粒细胞（CD11b+CD16+）
8-13、T细胞及其亚群
T细胞（CD3+CD56−）亚群，包括辅助性T细胞（CD4+）、细胞毒性T细胞（CD8+）、调节性T细胞（CD127dimCD25+）、γδ T细胞（TCR γδ+）和粘膜相关不变T细胞(MAIT; TCR Vα7.2+CD161+)
为了研究T细胞的成熟状态，CD45RA和CCR7（CD197）被用作标记物，用于区分幼稚（CD45RA+CD197+）、中枢记忆（CD45RA-CD197+）、效应记忆（CD45A-CD197-）和终末分化的效应记忆T细胞（CD45RA+CD197-）。这些成熟阶段还可以进一步使用CD27和CD28进行分类。
此外，为了更广泛地研究不同的T细胞，我们还纳入了与耗竭、激活、免疫检查点和共刺激相关的标志物，如CD38、CD69、CD278 （ICOS）、CD279 （PD-1）、HLA-DR和TIGIT。该小组还包括趋化因子受体，这是招募和引导免疫细胞到感染、炎症和组织损伤部位所必需的。我们小组中包括的趋化因子受体为CD183 （CXCR3）、CD185 （CXCR5）、CD194 （CCR4）和CD196 (CCR6)，它们能够进一步分类辅助性T细胞。此外，整合素β7和CD103（整合素αE）可以分别提供更多关于肠道细胞归巢和组织驻留细胞的信息。
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四、流式结果图
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参考文献
Forty-two Color Flow Cytometry Panel Data Collected with the ID7000™ Spectral Cell Analyzer for Identifying Cellular Subsets in Human Peripheral Blood
