OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice.DOI: 10.1002/cyto.a.24740
该41色面板已被用于表征小鼠中的淋巴和骨髓细胞亚群分析。由于关注T细胞、它们的活化和分化状态以及它们的几种共抑制分子和效应分子的表达，该组还分析抗原呈递细胞上这些共抑制分子的配体。该组能够对CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞、γδΤ细胞、NKT细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞进行深入的表型表征。该小组被设计用于分析和比较感染性疾病的不同小鼠模型中的免疫应答，但也可以扩展到其他疾病模型，例如肿瘤或自身免疫性疾病。
T细胞是适应性免疫系统的重要支柱，提供对病原体或改变的细胞的抗原特异性应答，它们可以被细分为不同的类别：常规T细胞，包括CD4+T辅助细胞、CD4+FoxP3+调节性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞;以及非常规T细胞，包括NK（NKT）和γδΤ细胞。T细胞被激活、增殖和分化，但可能表现出称为衰竭的功能障碍状态，通常以共抑制分子如PD-1或LAG-3的表达为特征。本文描述一个新的面板和门控策略，以研究表达的多个共抑制分子及其各自的配体的T细胞，B细胞，NK细胞，巨噬细胞/单核细胞，中性粒细胞，和树突状细胞（DC）。
实验信息与应用：
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OMIP-93中使用的试剂：
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将细胞用Zombie NIR活/死活力染色、相应的细胞外抗体染色，固定和透化并用相应的细胞内抗体染色。在5L Cytek Aurora上获取数据。代表性的门控策略如图A所示。
遵循明确定义的谱系标志物的不同层次，允许我们分析这些群体上功能标志物的表达。通过Zombie NIR Live/dead排除死细胞。白细胞被鉴定为CD45+。我们首先鉴定了嗜酸性粒细胞和B细胞（CD19+），然后对γδΤ细胞（CD3+TCRγδ+）进行门控。我们进一步将CD3+TCRγδ亚群分类为NKT细胞（CD3+NK1.1+），并通过对CD4与CD8作图来鉴定经典CD4+和CD8+T细胞。在CD4+区室内，我们将Treg鉴定为FoxP3+CD25+T细胞。排除B细胞和T细胞后，NK细胞被鉴定为NK1.1+细胞。
我们将中性粒细胞鉴定为CD11b+Ly-6G+。巨噬细胞和单核细胞被鉴定为CD11b+F4/80+。使用Ly-6C，我们可以将该群体进一步区分为经典Ly-6C高炎性单核细胞（与人CD14+单核细胞相当）和非经典Ly-6C低驻留单核细胞（与人CD16+单核细胞相当）。CD11c可以在T、B和NK细胞的亚群上表达，但是通过排除门控树中较高的这些群体，我们可以将树突状细胞鉴定为CD11c+细胞。DC可以进一步分为浆细胞样DC（pDC）（CD11clowSiglecH+），其能够在活化时产生I型干扰素;常规树突状细胞1（cDC1），其擅长交叉呈递，如CD11c+CD11bXCR1+；和诱导Th2应答的常规树突状细胞2（cDC2），如CD11c+CD11b+。
为了进一步分析T细胞区室并表征其活化和分化状态，我们包括针对CD69、CD25、CD44、CD62L、CD127、CD27和杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1（KLRG-1）的抗体。门控CD44与CD62L鉴定幼稚（CD62LhiCD44lo）、中央记忆（CD62LhiCD44hi）和效应（CD62LloCD44hi）T细胞。CD69表达被分析为B、NK和T细胞最近活化的标志物，或者可以用于在一些组织如肝脏中将中央记忆细胞进一步分化为驻留记忆T细胞（TRM）。这些标志物通过不同的途径抑制免疫应答。
门控策略和T细胞分析：
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（A）门控策略用于识别嗜酸性粒细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。在T细胞室中，可以识别出CD4+T细胞、Treg、CD8+T细胞、NKT细胞和γδT细胞。分化状态可以通过检测CD44和CD62L来确定。NK细胞通过NK1.1进行鉴定，通过分析CD11b和CD27的表达，可以确定其成熟程度。巨噬细胞可分为Ly-6Clow和Ly-6Chigh群体。树突状细胞可细分为pDCs、cDC1和cDC2群体。
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（B）从PbA感染（深色）和幼稚（浅）C57BL/6小鼠脾脏中分离的CD4+（蓝色）和CD8+T（灰色）细胞的直方图。活化和分化标记物、效应分子、共抑制分子及其配体的表达可以用该组分析。
