在Western Blot（WB）实验中，电泳、转膜、孵育抗体、发光检测每一步都耗费大量时间、样本与试剂。尤其是一些珍贵的细胞、组织样本，样本量较少，无法重复上样试验，或可能还会遇到在最后的一瞬间才反应过来，好像加错了抗体……难道要重新跑胶、重新转膜，把宝贵的样品再消耗一遍嘛？这时候，膜再生就成了我们的“省时省力”和“后悔药”的神器。继上期介绍的回收抗体，今天小优细节君就来和大家聊聊WB中另一邪修技术——膜再生。
什么是膜再生
膜再生（Stripping），顾名思义，就是去除已经结合在印迹膜（PVDF 或 NC 膜）上的抗体。通过这种方式，我们可以在一张膜上先后检测多个不同的目标蛋白，还能消除不同批次电泳、转膜带来的系统误差。
根据其作用机制的不同，目前主要的膜再生方法可分为以下三类：
01 改变抗体构象法（低pH法）
利用极端的pH环境（如pH 2.2的甘氨酸-HCl）使抗体发生可逆性变性，改变其空间构象，从而使其从抗原上“脱落”下来。
02 打断化学键法（还原剂法）
使用还原剂（如β-巯基乙醇或DTT）破坏抗体分子内的二硫键，使抗体分子结构解体；同时配合去垢剂SDS破坏抗体与抗原之间的疏水相互作用，从而达到强力洗脱的目的。
03 加热辅助法
在化学处理的基础上，辅助加热（通常为50-55°C）可以加速抗体的变性和解离过程，缩短再生处理的时间。但这种方法常与还原剂法配合使用，达到“1+1>2”的效果。
目前市面上有多种类型的膜再生液或试剂盒，它们各有优劣。选择合适的再生液，需要综合考虑具体的实验需求、抗原的稳定性以及成本预算。
如何选择？
· 追求效率和成本：选择强碱性再生液，但需注意防护。
· 追求蛋白保护和多次使用：选择温和型/中性商品化再生液，能更好地保护珍贵样本。
· 常规实验、预算有限：可自行配制酸性再生液，性价比高，但需要优化处理时间。
若遇到特定抗体洗脱效果不佳，可考虑适当延长孵育时间，并确保孵育温度不低于20℃——温度过低会显著影响洗脱效果。
膜再生的局限
虽然膜再生技术非常实用，但它并非万能，存在一些固有的局限性，使用时需要心中有数。
01 蛋白损失不可逆
每一次膜再生处理的主要目的都是洗脱抗体，但同时也会不可避免地洗掉一些结合在膜上的抗原蛋白。因此，随着再生次数的增加，膜上的蛋白总量会逐渐减少，检测信号也会相应衰减，对于样本中表达量较低的蛋白，影响会更明显。通常认为一张膜的再生次数不宜超过3-5次，具体要根据再生后的结果进行判断和调整。
Fig 1 同一蛋白膜再生前后对比图
△点击放大图片
02 仅适用于化学发光检测
膜再生只能洗脱抗体，无法去除已经沉淀在膜上的有色沉淀物。如果试验使用的是DAB、NBT/BCIP等显色底物进行检测，再生是无法奏效的。因此，计划进行膜再生的实验，必须使用ECL等化学发光检测体系。
03 不适用于绝对定量
这一点在很多实验中容易被忽略，很多人会直接将再生前后的条带进行灰度分析，并用于定量比较。但实际上，Stripping后蛋白总量、膜表面状态以及背景水平都可能发生变化。也就是说，即使条带仍然存在，也并不代表其定量结果仍然可靠。例如，在检测磷酸化蛋白与总蛋白的比例时，虽然可以使用同一张膜依次剥离分别检测，但必须谨慎解释结果，再生后的信号衰减可能引入误差。
04 抗体残留引发背景干扰
对于高亲和力、特异性极强的抗体，再生液很难完全洗脱残留抗体，二次孵育后会出现非特异性杂带、背景脏、信号重叠等问题，严重影响实验结果判读。
05 膜类型
NC膜和PVDF膜都支持再生处理，但PVDF膜是首选。PVDF膜比NC膜更加坚韧，能更好地耐受反复洗涤和极端pH处理，蛋白损失相对更小。
膜再生的试验细节
那在试验中，我们如何最大程度的利用这个“邪修”呢，小优细节君这里总结了一些经验供大家参考：
01 检测顺序：先低丰度，后高丰度
若需进行膜再生，建议先检测表达量低、难检测的目的蛋白，最后再检测表达量高的蛋白，eg：内参（如Actin、GAPDH）。这样能最大限度地确保关键信号不会丢失。
Fig 2 膜再生后GAPDH残留
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02 严防干膜
在再生处理过程以及后续的洗涤步骤中，绝对不能让膜干燥。一旦干燥，残留的抗体分子可能会不可逆地结合在膜上，导致再生失败或后续背景异常升高。
03 再生前后充分洗涤
在膜再生处理前后，都需要用洗涤缓冲液（如TBST）充分洗涤，处理前洗涤以去除膜表面残留的ECL底物和游离抗体，再生后洗涤以确保彻底去除残留的再生液。否则任何残留的试剂都可能干扰后续的封闭和抗体孵育，影响最后的结果。
04 验证再生效果
在重新封闭和加入新抗体之前，可以将再生后的膜用ECL底物孵育再曝光一次：
· 如果没有条带，证明之前的抗体洗干净了，可以放心进行下一步。
· 如果还有条带，说明洗脱不完全，需要延长处理时间，或者使用效果更强的膜再生液。
05 严格控制再生孵育的时间和温度
需注意的是，再生孵育时间并不是越长越好，过长时间的 stripping 往往意味着更多蛋白流失。尤其是强 stripping 条件下，长时间孵育甚至可能直接破坏目标表位。建议参考使用产品的说明书进行操作。
写在最后：
膜再生是一把双刃剑。用得好，一张膜可以产生多组高质量数据，既节省了珍贵的样本资源，又提高了实验效率；用不好，可能会因为信号衰减或背景升高得出不可靠的结论。判断一次膜再生是否“成功”，并不只是看是否还能看到条带，更重要的是：条带是否仍然清晰、背景是否可控、结果是否仍具有重复性，以及最终数据是否可信。
最终的判定标准只有一个：实验结果的质量，实验质量，永远比“省一张膜”更重要！
部分相关产品：
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| abs958-500mL | Western一抗二抗去除液（酸性） |
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| abs968-500mL | Western一抗二抗去除液（弱碱性） |
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| abs932-1卷（30cm×3m） | PVDF膜（0.45μm） |
| 29947809 | Cytiva Elite 0.45μm PVDF转印膜 |
| abs931-1卷（30cm×3m） | PVDF膜（0.22μm） |
| 30011156 | Cytiva Elite 0.2μm PVDF转印膜 |
| abs960-1卷（30cm×3m） | NC膜（0.45μm） |
| 10600002 | NC 0.45um转印膜 |
| abs959-1卷（30cm×3m） | NC膜（0.22μm） |
| 10600001 | NC 0.2um转印膜 |
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| 9997S | Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) |
参考文献：
1. Yeung YG, Stanley ER. A solution for stripping antibodies from polyvinylidene fluoride immunoblots for multiple reprobing. Anal Biochem. 2009 Jun 1;389(1):89-91. doi: 10.1016/j.ab.2009.03.017
2. Bass JJ, Wilkinson DJ, Rankin D, Phillips BE, Szewczyk NJ, Smith K, Atherton PJ. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 2017 Jan;27(1):4-25
