当 CAR-T、TCR-T 席卷临床，为肿瘤治疗带来突破性进展，却也伴随多重棘手挑战：疗效不稳、易复发，体外扩增 T 细胞普遍存在耗竭衰老、亚群混杂问题；还易诱发细胞因子风暴、神经毒性、脱靶损伤，异体 TCR-T 更有移植物抗宿主病风险。
如何精准看透体外扩增 T 细胞？本篇36 色全光谱流式方案重磅登场，帮助解锁外周血与扩增 T 细胞的双重解析密码。
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CAR-T疗法面临挑战
01 生物学背景
该方案可分析CD4⁺、CD8⁺记忆 T 细胞亚群（初始 / 干细胞样记忆 T 细胞、中枢记忆 T 细胞、效应记忆 T 细胞、效应记忆再表达 CD45RA T 细胞）、调节性 T 细胞亚群（CD45RA⁺、CD39⁺）以及辅助性 T 细胞亚群（滤泡辅助 T 细胞、Th1、Th2、Th17 细胞）。通过胞内染色，可评估颗粒酶 B（细胞毒性）、Ki-67（增殖能力）等功能标志物；借助表达动力学各异的标志物，可精细解析 T 细胞活化状态；还能全面评估T 细胞耗竭、衰老特征（已知与免疫治疗耐药性相关）。
方案包含pHLA - 葡聚糖体或抗 TCR 抗体的 TCR 染色步骤，可用于检测TCR 特异性及（或）转导效率；同时设置PD-1 受体占有率检测模块，可量化结合了免疫检查点抑制剂（ICI）抗体的 T 细胞比例。
02 实验信息
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类别 |
具体内容 |
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样本类型 |
人外周血、人外周血单个核细胞（PBMC）、体外扩增的人 T 细胞 |
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方案类型 |
36 色全光谱流式细胞术方案、深度 T 细胞免疫表型分析方案、OMIP 标准化方案（OMIP-119）、适配免疫治疗（ICI、过继性 T 细胞疗法）的检测方案 |
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实验方案 |
1. 36 种荧光素标记抗体染色（含谱系、分化、活化、共刺激、功能、耗竭、衰老相关标记）； |
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2. 活死染色（Live/Dead Blue）； |
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3. 胞内染色（颗粒酶 B、Ki-67、FoxP3）； |
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4. PD-1 受体占有率（RO）检测； |
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5. TCR 染色（pHLA-dextramer /抗 TCR 抗体） |
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6. 数据分析：FlowAI 质控、opt-SNE 降维、FlowSOM 聚类分析 |
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使用仪器 |
全光谱流式细胞仪 |
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细胞类型 |
人外周血单个核细胞（PBMC）；体外扩增人 T 细胞； |
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细分亚群：CD4⁺T 细胞、CD8⁺T 细胞、调节性 T 细胞（Treg）、辅助 T 细胞（Th1/Th2/Th17/Tfh）、CD4⁺细胞毒性 T 细胞（CD4 CTL）、耗竭 T 细胞、衰老 T 细胞、记忆 T 细胞亚群（Tn/Tscm/Tcm/Tem/Temra） |
03 配色方案&数据结果说明
配色方案
| 标志物 | 荧光染料 | 克隆号 | 标志物意义 |
| 一、核心标记物（谱系 / 活力） | |||
| CD3 | S UV 387 | OKT3 | T 细胞谱系 |
| LD | Live/Dead Blue | N/A | 活细胞甄别 |
| CD4 | SV538 | SK3 | CD4⁺T 细胞谱系 |
| CD8 | RB613 | RPA‑T8 | CD8⁺T 细胞谱系 |
| 二、分化标记物 | |||
| CD45RA | BUV395 | 5H9 | T 细胞记忆分型 |
| CCR7 | SB645 | 3D12 | 中枢记忆 |
| CCR4 | BUV615 | 1G1 | Th2 分化 |
| CCR6 | BV711 | G034E3 | Th17 分化 |
| CD27 | Pacific Blue | M‑T271 | 记忆维持 / 分化 |
| CD28 | BV750 | CD28.2 | 共刺激 / 分化 |
| CD62L | RB545 | DREG56 | 初始 / 归巢 |
| CD95 | PE‑Fire 640 | DX2 | 干细胞记忆 |
| CD127 | SR718 | A019D5 | 记忆前体 / 存活 |
| CXCR5 | RB705 | RF8B2 | Tfh 分化 |
| 三、活化标记物 | |||
| CD38 | S YG581 | S17015F | T 细胞活化 |
| HLA‑DR | APC‑Fire 810 | L243 | 晚期活化 |
| OX40 | BUV496 | ACT35 | 活化 / 共刺激 |
| 4‑1BB | PerCP‑Fire 806 | 4B4‑1 | 活化 / 共刺激 |
| 四、共刺激标记物 | |||
| CD226 | BV421 | 11A8 | 共激活受体 |
| ICOS | BUV805 | DX29 | 共刺激受体 |
| 五、功能标记物 | |||
| Ki‑67 | BUV563 | SolA15 | 细胞增殖 |
| Granzyme B | APC‑Fire 750 | QA16A02 | 细胞毒性 |
| 六、耗竭 / 抑制标记物 | |||
| PD‑1 | BV480 | EH12.1 | 耗竭 / PD‑1 占有率 |
| PD‑1 | APC | MIH4 | 耗竭 / PD‑1 占有率 |
| LAG‑3 | BUV661 | 3DS223H | T 细胞耗竭 |
| CTLA‑4 | BUV737 | 14D3 | 免疫抑制 |
| CD101 | RB744 | V7.1 | 耗竭 |
| TIGIT | PE‑Cy7 | A15153G | T 细胞耗竭 |
| TIM‑3 | BB515 | 7D3 | T 细胞耗竭 |
| CD39 | PE‑Fire 744 | A1 | Treg 免疫抑制 |
| 七、衰老标记物 | |||
| KLRG1 | BV786 | 2F1 | T 细胞衰老 |
| CD57 | PerCP | HI57a | 复制性衰老 |
| 八、其他关键标记物 | |||
| FoxP3 | NIR 685 | 206D | 调节性 T 细胞 |
| TCR | PE | N/A | TCR 特异性 / 转导效率 |
结果分析
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(A) 排除碎片与细胞粘连体后，基于FSC和SSC圈选淋巴细胞，再从中筛选活的 CD3⁺ T 细胞。数据来自健康人外周血单个核细胞（PBMC）。
(B) 向健康人 PBMC 样本中加入纳武利尤单抗，检测PD-1 受体占有率。MIH4 为非竞争性抗体，EH12.1 为竞争性抗体（针对纳武利尤单抗）。所有群体均预先圈选至活的单细胞淋巴细胞。
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CD4⁺ T 细胞：
· 核心亚群：CD4⁺ CTL（颗粒酶 B⁺）、Treg（CD25⁺FoxP3⁺）；
· Treg 按 CD45RA/CD39 分 CD45RA⁺CD39⁻、CD45RA⁻CD39⁺亚群。
· 非 Treg（CD25⁻FoxP3⁻）：Tfh（CXCR5⁺CD45RA⁻）；
· 其他辅助 T 细胞按 CXCR3/CCR6/CCR4 分 Th1（CCR6⁻CXCR3⁺）、Th17/Th1（CCR6⁺CXCR3⁺）、Th17（CCR6⁺CXCR3⁻CCR4⁺）、Th2（CCR6⁻CXCR3⁻CCR4⁺）。
· 记忆亚群（CD45RA/CCR7/CD27/CD28/CD95）：Tn、Tscm、Tcm、Tem；CD4⁺ Tem 再分早期（CD28⁺CD27⁺）、类早期（CD28⁺CD27⁻）
CD8⁺ T 细胞：
· 记忆亚群参照 CD4⁺非 Treg 标准，新增 Temra（CCR7⁻CD45RA⁺）；
· CD8⁺ Tem/Temra 按 CD28/CD27 分早期、类早期、中期、终末状态。
双阴性 T 细胞（DN）：CD4⁻CD8⁻。
数据来源：健康人 PBMC；灰色框：体外扩增 T 细胞样本中 CD4⁺/CD8⁺抗原特异性 TCR 检测结果。
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(E) 外周血与体外扩增 T 细胞中，CD4⁺/CD8⁺亚群的 T 细胞活化、共刺激、功能、耗竭 / 抑制、衰老及分化标志物表达谱。
小优有妙计
FlowAI中的good/bad events
是依据什么区分的？
FlowAI可对流式数据进行自动化的质量控制和数据清洗，以去除因仪器波动或样本问题产生的异常信号，主要包括以下三类：
由于液流不稳定导致的信号波动；
在数据采集过程中出现的瞬时干扰；
超出检测器线性范围的信号。
FlowSOM的优势是什么？
传统手动圈门高度依赖操作人员的经验和预设策略，容易遗漏稀有细胞群或无法分辨表型高度重叠的群体。FlowSOM则无偏见地审视所有数据维度，能揭示手动难以发现的隐藏亚群。
FlowSOM利用自组织映射（SOM）算法，根据所有选定标记物的表达谱，自动将表型相似的细胞聚集到一起，形成不同的“元簇”，常与t-SNE、UMAP等降维可视化方法结合使用。
参考文献：
· OMIP-119: A 36-Color Full-Spectrum Flow Cytometry Panel for Deep Immunophenotyping of Peripheral Blood and ExVivo Expanded Human T Cells
· CAR-T cell therapy for cancer: current challenges and future directions
