适配 PBMC 的光谱流式方案，能否直接应用于全血样本？
血液冻存会对免疫表型检测产生哪些影响？
想要缩短实验时长，过夜染色是否可行？
这篇文献围绕以上三大问题展开系统研究，从试剂优化、样本前处理到染色策略全面解析，且听小优细细道来~
一、生物学背景
本研究改良 40 色光谱流式方案以适配全血检测，同时评估细胞冻存影响及过夜染色的应用价值，核心结果如下：
1、整改实验缺陷：解决了 IgG 荧光信号缺失、PerCP-eFluor710 荧光光谱异常问题（调整步骤 + 更换试剂）；
2、冻存的影响：显著改变粒细胞形态与活性，冻存与新鲜样本结果不可直接比对；约 30% 设门细胞亚群比例变化，T 细胞、树突状细胞、单核细胞亚群受影响最显著；
3、过夜染色的优劣：优势为抗体用量减少 5～20 倍（降成本）、提升关键标志物分辨度；不足为 CD2、CD39 等标志物检出下降，影响类 NKT 细胞与调节性 T 细胞鉴定。
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二、实验信息
| 项目 | 详细内容 |
| 样本 类型 | 1. 样本来源：健康人外周静脉全血（3 例健康受试者，1 女 2 男，24～30 岁，锂肝素抗凝采血） |
| 2. 分组：新鲜全血、冻存全血两类样本 | |
| 3. 预处理：采集1.5ml全血,统一裂红处理后制备白细胞悬液 | |
| 方案 类型 | 基于 OMIP069 原 40 色 PBMC 光谱流式方案改良，适配全血样本，分为2 种染色方式（室温&过夜）） |
| 1. 染色：①室温 30min 短时常规染色；②4℃避光 16～20h 过夜低温染色（低成本优化方案） | |
| 2. 保存：①新鲜样本即时检测；②裂红后细胞 CS10 冻存液 - 80℃冻存，后续复苏检测 | |
| 使用 仪器 | 光谱流式细胞仪（UV16V16B14YG10R8 ） |
| 细胞 类型 | CD45⁺全白细胞亚群： |
| 1. 髓系：中性粒细胞、嗜酸粒细胞、经典 / 非经典单核细胞、CD1c⁺/CD141⁺树突状细胞（mDC） | |
| 2. 淋巴系：CD4⁺T、CD8⁺T（各记忆 / 初始亚群）、Treg、γδT、NKT、B 细胞各亚群、NK 细胞、固有淋巴细胞 ILC |
三、配色方案&数据结果
1、配色方案
为解决染色补偿问题，对原实验方案两处进行调整：
①IgG 改为单独分步染色；
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IgG 染色效果对比：左侧为将 IgG 混入混合抗体液共染，右侧为 IgG单独加样染色；
结果表明，单独染色可明显提升 IgG 染色质量。
②TCRγδ 的荧光标记由 PerCP-eFluor710 更换为 PerCP-Vio700，配色方案见下
| 标志物 | 荧光素 | 克隆号 | 标志物意义 |
| 一、通用白细胞 | |||
| L/D | / | / | 死/活细胞鉴别 |
| CD45 | PerCP | 2D1 | 白细胞共同抗原 |
| 二、淋巴细胞大谱系（T/B/NK/NKT） | |||
| CD3 | BV510 | SK7 | T细胞谱系 |
| CD4 | cFluor YG584 | SK3 | T helper谱系 |
| CD8 | BUV805 | SK1 | 细胞毒性T细胞 |
| CD19 | Spark NIR 685 | HIB19 | B细胞谱系 |
| CD20 | Pacific Orange | HI47 | 成熟B细胞 |
| IgM | BV570 | MHM88 | B细胞成熟度 |
| IgD | BV480 | IA62 | 初始B/未切换B |
| IgG | BV605 | G18145 | 表面IgG⁺B/浆母细胞 |
| CD56 | BUV737 | NCAM16.2 | NK/NKT（NCAM） |
| CD16 | BUV496 | 3G8 | NK亚群/髓系激活 |
| TCRγδ | PerCPVio700 | REA591 | γδ T/NKT-like |
| 三、T细胞分化/记忆/激活/调节 | |||
| CD45RA | BUV395 | 5H9 | 初始/记忆轴 |
| CCR7 | BV421 | G043H7 | 中央记忆 |
| CD27 | APC-H7 | MT271 | 记忆/共刺激历史 |
| CD28 | BV650 | CD28.2 | 共刺激能力 |
| CD57 | FITC | HNK1 | 末端效应T |
| PD-1 | BV785 | EH12.2H7 | 活化/耗竭 |
| Fas | PE-Cy5 | DX2 | 活化/凋亡敏感化 |
| CD38 | PE-Fire 810 | S17015F | 活化/增殖 |
| CD39 | BUV661 | TU66 | 调节性表型 |
| CD25 | PE-AF700 | 3G10 | IL-2Rα |
| CXCR5 | BV750 | RF8B2 | 滤泡归巢 |
| CCR6 | BV711 | G034E3 | Th17倾向/黏膜归巢 |
| 四、NK/细胞毒受体 | |||
| NKG2D | BUV615 | 1D11 | 活化型细胞毒受体 |
| NKG2A | APC | REA110 | 抑制型受体 |
| NKG2C | PE | REA205 | 活化/适应性NK受体 |
| NKp30 | PE-Dazzle594 | P3015 | 天然细胞毒受体 |
| 五、髓系/单核/树突状细胞（DC） | |||
| CD14 | SB550 | 63D3 | 经典单核细胞 |
| CD11c | eFluor 450 | 3.9 | mDC/活化单核 |
| CD141 | BB515 | 1A4 | cDC1样 |
| CD1c | AF647 | L161 | cDC2样 |
| HLA-DR | APC Fire 810 | L243 | MHC-II抗原提呈水平 |
| CD123 | SB436 | 6H6 | pDC倾向/早期髓系 |
| CD24 | PE-AF610 | SN3 | B/DC/单核微调标记 |
| 六、趋化因子受体/迁移归巢 | |||
| CCR5 | BUV563 | 2D7 | 炎症归巢/效应记忆 |
| CXCR3 | PE-Cy7 | G025H7 | Th1/Tc1趋化 |
2、过夜样本与样本冻存对免疫细胞影响
①过夜染色与样本冻存，对白细胞活性及细胞形态的影响
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A) 对同一供体的新鲜血、冻融血，分别开展室温 30 min 常规染色与 4℃ 16～20 h 过夜染色，展示各组代表性结果。样本经筛选、去除红细胞和粘连细胞后圈选 CD45⁺细胞：
首行通过 FSC/SSC 分析细胞形态，第二行标注各细胞亚群，末行利用活死固定蓝染料检测细胞活性，阳性界值依据对应样本的活死 FMO 对照设定。
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B) 新鲜血过夜染色、冻存血常规 / 过夜染色各组，各类免疫活细胞占比（n=3）。
C) CD45⁺细胞中高 SSC、低 SSC 细胞及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的占比分布（n=3）。
②过夜染色与样本冻存，免疫细胞占比、活化及趋化受体标志物表达变化
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A) 以室温 30 min 染色的新鲜全血为参照，对比新鲜血过夜染色、冻存血 30 min 染色、冻存血过夜染色三组
B) 各组对比 30 min 染色新鲜样本，统计全部人工设门细胞中活化、分化、趋化受体标志物的中位荧光强度变化；负值代表荧光强度下降，正值代表上升，单个圆点代表某亚群的单个标志物。
③过夜染色与样本冻存，对标志物分辨效果的影响
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选用同一天制备的同源配对血样，采用荧光直方图叠加图展示不同处理、染色方案下，标志物荧光强度与本底荧光的差异。
三、不同样本处理与染色方案下细胞分群分辨效果评价
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(A) 同批次配对血样的代表性染色双参数散点图，直观体现样本冻存、染色方式对细胞亚群区分效果的不同影响。
(B) TCRγδ、CD3、CD19、CD20、CXCR3、CXCR5、CD2 在对应细胞亚群中的染色指数，详见附图。
小优有妙计
· 不同样本的裂红时间是否相同？
裂红时间会因样本不同而有差异，可参考下表
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· 全血样本冻存及复苏流程？
冻存：洗涤后的细胞沉淀，用 1 mL 预冷冻存液重悬，分装至冻存管，放入程序降温盒，-80℃保存。
复苏：37℃水浴快速解冻（留少量碎冰），加 9 mL 预热的 10% 胎牛血清 - RPMI 1640 培养基，500 g 离心 10 min，去除冻存液。
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abs9474组织保存液，长效保存24-48h，批量样本更省心
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