| 梦想 | 现实 |
|
衰老、疾病、 小胶质细胞！ 国自然大热选题！ |
· 小胶质细胞无单一专属标志物 · 小鼠脑组织富含髓鞘，细胞自发荧光极强，造成假阳性、细胞分群模糊， · 免疫荧光定量差、单细胞测序成本高且分析难度大，有没有更合适的替代检测方法？ |
小胶质细胞是大脑重要的固有免疫细胞，表型变化与神经发育、神经退行性疾病密切相关。这份针对衰老、疾病模型的小鼠脑小胶质细胞流式表型分析实操攻略，请各位流式人收好！
一、生物学背景
△点击放大图片
本方案优化细胞制备流程，避免小胶质细胞离体活化；结合单细胞测序筛选的标志物，利用流式细胞术可从小鼠脑组织中鉴定出稳态型、疾病相关型 (DAM)、干扰素应答型 (IRM)、脂滴蓄积型 (LDAM) 四类小胶质细胞，并分析年龄、性别对表型分布的影响。
该方案兼容性强，搭配五激光光谱流式仪可拓展检测指标，也适用于不同脑区与疾病模型；且无需细胞分选，操作简便。相较于单细胞测序，本方法成本更低、检测通量更高，适合多实验组间的表型分布对比。
二、实验信息
|
分类 |
具体内容 |
|
样本类型 |
实验动物：C57BL/6N 品系成年小鼠（3~25 月龄） |
|
组织样本：以小鼠海马体组织为核心样本，可拓展至大脑皮层及小鼠其他脑区； |
|
|
应用模型：正常衰老小鼠、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）模型小鼠脑组织，用于研究衰老与疾病进程中的小胶质细胞变化。 |
|
|
方案类型 |
标准化流式细胞术分型实验方案 |
|
使用仪器 |
光谱流式细胞仪；全自动组织处理器；FlowJo |
|
细胞类型 |
小鼠脑组织固有免疫细胞 —— 小胶质细胞 |
|
依据分子标志物分为 4 种功能表型： |
|
|
1. 稳态型小胶质细胞（Homeostatic microglia） |
|
|
2. 疾病相关小胶质细胞（DAM, Disease-associated microglia） |
|
|
3. 干扰素应答型小胶质细胞（IRM, Interferon response microglia） |
|
|
4. 脂滴蓄积型小胶质细胞（LDAM, Lipid-droplet accumulating microglia） |
|
|
界定特征：目标小胶质细胞表型为 CD11b⁺CD45 中等表达，可排除外周浸润免疫细胞干扰。 |
三、配色方案&数据结果
配色方案
| 标志物 | 荧光染料 | 克隆号 | 标志物意义 | |||
| 核心鉴定标记物 | ||||||
| CD11b | BV421 | M1/70 | 泛小胶质细胞标志物 | |||
| CD45 | BV786 | 30-F11 | 免疫细胞 | |||
| 稳态小胶质细胞（Homeostatic MG） | ||||||
| P2RY12 | AF810 | S16007D | 稳态小胶质细胞标志 | |||
| CLEC7A | APC | REA154 | 辅助区分稳态（阴性）与疾病相关状态（阳性） | |||
| 疾病相关小胶质细胞（DAM） | ||||||
| CD11c | BV605 | N418 | DAM标志，参与吞噬与免疫激活 | |||
| TLR2 | PE-CY7 | QA16A01 | DAM标志，模式识别受体，介导炎症信号 | |||
| CLEC7A | APC | REA154 | DAM标志，C型凝集素受体，识别病原/损伤信号 | |||
| 干扰素反应小胶质细胞（IRM） | ||||||
| BST2 | BV650 | 927 | IRM标志，IFN信号通路激活指标 | |||
| 脂滴积累小胶质细胞（LDAM） | ||||||
| CD63 | PE | NVG-2 | LDAM标志，脂滴积累与溶酶体功能异常 | |||
实验结果
△点击放大图片
小胶质细胞的圈门策略
A. 确定活细胞群体的参考参数
B. 筛选单细胞，排除细胞双联体
C. 利用五激光光谱流式细胞仪筛选自发荧光阴性细胞群
D. 鉴定小胶质细胞群（CD11b 阳性、CD45 中等表达）
△点击放大图片
小胶质细胞表型鉴定
A. 稳态型小胶质细胞：判定标准为P2RY12 阳性、CLEC7A 阴性。
B. 疾病相关型小胶质细胞：判定标准为CD11c 高表达、CLEC7A 高表达，或CD282 阳性、CLEC7A 阳性。
C. 干扰素应答型小胶质细胞：依据CD317 荧光直方图判定。
D. 脂滴蓄积型小胶质细胞：依据CD63 荧光直方图判定。
小优有妙计
Q：小鼠脑组织如何处理成单细胞悬液？
可采用小鼠脑组织解离试剂盒 + 摇床/全自动组织处理器的联合方案进行处理。
1、动物处理
按照规范流程对小鼠实施安乐死；强烈建议进行心脏灌流，洗去体内循环免疫细胞与血液，减少后续杂质、自发荧光干扰。
2、取脑操作
① 沿头部中线剪开并分离皮肤与颅骨，剪断鼻桥，由尾侧向吻侧沿颅骨纵缝开颅。
② 小心剥离颅骨（避免损伤脑组织），完整取脑，放入约 10 mL 预冷 D-PBS 中漂洗。
③ 脑组织移至冰上解剖板，吸干液体，中线切开皮层，分离海马体（可替换为其他脑区）。
△点击放大图片
3、组织剪碎
机械解离，用锋利的眼科剪将其剪碎成 0.5-1 mm³ 的小块
4、组织消化解离
(1) 酶消化：将组织块（约100-200mg）转移至离心管，放入装有1 mL解离液的5 mL圆底试管中，37℃恒温培养箱中静置消化60 min，每隔10分钟上下颠倒混匀试管；
(2) 也可采用组织解离液+全自动处理器联合处理的方式，在全自行组织处理器中运行相应程序即可实现自动解离。
(3) 70μm 细胞筛网过滤，预冷 1×PBS 3-5mL 冲洗筛网；随后加入5 mL PBS溶液进行洗涤，4℃条件下以400 xg离心5分钟，弃去上清液，重悬沉淀；
△点击放大图片
Q:小鼠脑组织处理中，杂质如何去除（去除髓鞘、组织碎片）？
· percoll 密度梯度配置（36%，100%）：Percoll和10×PBS，按照体积比9:1 ，配制 100% 等渗 Percoll；再用该液与RPMI-1640。按照体积比9:16 ，配制36% Percoll。
· 分离裂解：随后细胞悬液在室温条件下以低加速度（加速度1）和无制动的情况下，以800 xg离心20分钟，弃去上层磷脂和上清，沉淀用1xPBS缓冲液重悬；
· 将细胞悬液在4℃条件下以400 xg离心5 min，弃去上清；细胞沉淀用1x红细胞裂解液重悬，室温条件裂解5 min，随后在4℃条件下以400 xg离心5 min，弃去上清；
· 洗涤：1×PBS 重悬后 4℃ 400×g 离心弃上清，再次 PBS 重悬，备用。
△点击放大图片
更多相关产品和耗材
| 产品分类 | 产品编号 | 名称 | 规格 |
| 组织消化解离 | abs50098 | 小鼠脑组织解离试剂盒 | 10T/25T |
| 筛网 | abs7232 | 70um细胞筛网（200目，白色，底面过滤） | 50个/箱 |
| 免疫细胞预富集 | abs9102 | percoll | 100ml |
| 10XPBS缓冲液 | abs961 | PBS缓冲液（10×） | 500ml |
| 1640培养基 | abs9484 | RPMI 1640培养基（含L-谷氨酰胺，不含HEPES） | 500ml |
| 红细胞裂解液（1×） | abs9101 | RBC Lysis Buffer | 100ml |
| 阻断FCR非特异性染色 | S0B0599 | Mouse FcR Blocking Reagent | 200T |
| 染色缓冲液 | abs9475 | Flow cytometry staining buffer | 500ml |
| 死活染料 | 559925 | 7-AAD Staining Solution 2mL | 2ml |
| 流式鉴定 | S0B1692 | APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD45 Antibody (30-F11) | 50T |
| 流式鉴定 | S0B5160 | PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse/Human CD11b Antibody | 50T |
小鼠脑组织单细胞悬液染色结果（abs50098）
试剂盒将小鼠脑组织处理为单细胞悬液后流式检测细胞活率、CD45、CD11b染色结果
△点击放大图片
