前方高能！超难流式副本
视网膜：你好，我叫Retina，我真的很mini
小胶质细胞和巨噬细胞：我们真的不是复制粘贴哦
分不清，测不到。
别慌！本套流式方案出马，一招拆穿它们的身份，解锁视网膜细胞鉴定新玩法！
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一、生物学背景
髓系细胞（尤其是小胶质细胞和巨噬细胞）会在视网膜疾病中被激活，其炎症表型可决定视网膜病变的预后走向（改善或恶化）。然而，由于小鼠视网膜组织体积微小，且难以区分小胶质细胞与浸润性巨噬细胞，评估小鼠视网膜损伤后的髓系细胞反应仍存在较大挑战。
本文介绍了一种基于流式细胞术的实验方案，用于检测视网膜损伤后的小胶质细胞 / 巨噬细胞及其炎症表型。
二、实验信息
| 步骤 | 关键内容 |
| 样本类型 |
1. 实验动物：8-10 周龄雄性 C57BL6J 小鼠、P14 幼鼠（C57BL6J 背景） 2. 组织样本：小鼠视网膜组织 3. 模型样本：正常小鼠视网膜、缺血再灌注损伤（IR）视网膜、内毒素诱导葡萄膜炎（EIU）视网膜、氧诱导视网膜病变（OIR）视网膜 |
| 实验流程 |
动物麻醉与经心灌注 视网膜取材单 细胞悬液制备 流式染色 流式检测（BD LSRFortessa 流式细胞仪）与flowjo数据分析 |
| 方案类型 |
小鼠视网膜髓系细胞的流式鉴定、分型及炎症表型分析 1. 髓系细胞：小胶质细胞（CD11b⁺CD45low）、巨噬细胞（CD45hiCD11b⁺F4/80⁺）、单核细胞、粒细胞 2. 淋巴细胞：CD4⁺T 细胞、CD11b⁻CD45hi 淋巴细胞 3. 炎症表型细胞： - M1 样（促炎）：CD11c⁺CD206⁻髓系细胞 - M2 样（抗炎）：CD11c⁻CD206⁺髓系细胞 4. 单核细胞亚型：经典促炎单核细胞、非经典抗炎单核细胞 / 单核源性巨噬细胞 |
三、实验难点解析-视网膜取材及消化解离
1、小鼠视网膜如何取材及处理？
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(1) 采用颈椎脱臼法 / 二氧化碳吸入法）处死小鼠后，进行心脏预灌流。
(2) 灌流完成后，将小鼠置于俯卧位，从下方托住眼球，使眼球向外突出。
(3) 用镊子从下方固定眼球，使用锋利刀片沿角膜赤道部做环形切口。
(4) 用镊子夹持剖开的眼球，摘除箭头所示的晶状体和玻璃体。
(5) 轻挤剩余眼杯组织，将视网膜从眼球中剥离。
(6) 将灰白色半透明的视网膜转移至 2~3 mL 预冷的 HBSS 溶液中；星号标注部分为需弃除的晶状体、玻璃体与虹膜组织。
(7) 剔除残留的视网膜色素上皮（黑色组织，星号标注处）。
(8) 双侧眼球分离得到的视网膜置于 HBSS 溶液中，可用于后续实验处理。
2、小鼠视网膜单细胞悬液如何制备？
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1. 将视网膜置于HBSS中，用手术刀剪切成粒径小于 1 毫米的组织碎块；随后转移至 15 mL 锥形离心管，室温下 400×g 离心 5 分钟。
2. 向离心后的组织沉淀中加入 500 μL 消化液，充分重悬。
3. 将离心管置于管架上，整体放入37℃水浴孵育 30 分钟；每 10 分钟轻柔涡旋一次。
4. 加入 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基，终止酶解反应，同时提高细胞得率。
5. 将每份样品经 40 μm 细胞筛网过滤，共过滤 3 次；每次过滤后用 1 mL PBS冲洗细胞筛。借助注射器推杆的橡胶端轻柔研磨，使样品完全透过滤网。
6. 4℃条件下，400×g 离心 5 分钟。
7. 向细胞沉淀中加入 3 mL PBS 重悬，随后进行细胞计数。
8. 按照实验分组与所需细胞量，将细胞分装至 5 mL 流式管中。单管细胞量不得少于 1.5×10⁶个，方可开展后续实验。
四、配色方案&数据结果说明
配色方案
| 标志物 | 荧光染料 | 克隆号 | 标志物意义 |
| CD45 | AF700 | 30-F11 | 白细胞 |
| CD11B | PERCP | M1/70 | 髓系细胞 |
| F4 | APC | C1:A3-1 | 巨噬细胞 |
| CD11C | BV605 | N418 | M1 |
| CD206 | FITC | C068C2 | M2 |
| FC Block | / | / | 阻断FC端非特异性结合 |
| L/D | / | / | 排除死细胞干扰 |
数据结果
视网膜免疫细胞的设门策略
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1. 圈定主群：用 FSC vs SSC 识别细胞群体并排除碎片
2. 排除双细胞：用 SSC-H vs SSC-A（或 FSC-H vs FSC-A）密度图排除双细胞团
3. 选活细胞：活死染料 vs FSC-H 密度图，剔除染色死细胞，留存活细胞
4. 特异性标志物鉴定细胞亚群
· 泛白细胞标志物 CD45 用于识别免疫细胞群体（图 5E）。
· 联合 CD45 与髓系细胞标志物 CD11b 设门，可区分小胶质细胞（CD11b+ CD45 低表达）、髓系白细胞（CD11b+ CD45 高表达）和淋巴细胞（CD11b 阴性 CD45 高表达）（图 5F）
· 辅助性 T 细胞可通过 CD4 + 标记鉴定（图 5G）
· 小胶质细胞（CD11b+ CD45 低表达）和巨噬细胞（CD45 高表达 CD11b+ F4/80+）可进一步分为M1 样促炎细胞（CD11c+ CD206 阴性）和M2 样抗炎细胞（CD11c 阴性 CD206+）（图 5H、5I）。
· 单核细胞和粒细胞分别被鉴定为CD11b+ Gr-1 中表达和CD11b+ Gr-1 高表达细胞（图 5J）
三种不同视网膜损伤模型的代表性结果
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对照组（A）；缺血再灌注（IR）损伤组（B）氧诱导视网膜病变（OIR）组（C）；内毒素诱导葡萄膜炎（EIU）组（D）
CD11b 与 CD45 的密度图，用于区分小胶质细胞、髓系细胞和淋巴细胞（i）；CD45 高表达白细胞（ii）；以及 F4/80 阳性、CD11b 阳性巨噬细胞占 CD45 阳性细胞的比例（iii）。
缺血再灌注（IR）模型和内毒素诱导葡萄膜炎（EIU）模型中均观察到大量白细胞和巨噬细胞浸润，且 EIU 模型的反应更强。而氧诱导视网膜病变（OIR）模型则以小胶质细胞（CD11b 阳性、CD45 低表达）增殖为主。
五、小优有妙计-flower必备
Q 视网膜组织消化后，得到的单细胞悬液呈现红色怎么办？
可向消化后的组织中加入 1 mL 红细胞裂解液，室温孵育 5 分钟，清除样本内红细胞。
Q 视网膜组织消化后，得率较低怎么办？
初次实验可将 2~4 个完整视网膜合并为一份样本，后续可根据实际细胞得率酌情减少合并数量。一般每 3 个视网膜约可获得 1.5×10⁶个细胞，该数量可满足单组染色样本需求。
若是制备荧光减一对照（FMO）及各类阴性对照时，建议合并更多视网膜以保证细胞量。
流式好物推荐：abs9482组织解离试剂
abs9482眼睛样本流鉴定结果
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参考文献：
Multi-color Flow Cytometry Protocol to Characterize Myeloid Cells in Mouse Retina Research
