流式3min知识卡片
欢迎来到《流式3min·知识卡片》系列！
一张知识卡，搞定一个流式难题。覆盖指标选择、荧光素特性、滴定染色、固定破膜、电压补偿、数据分析等流式高频踩坑环节，减少试错，少走弯路~~
本期聚焦多色流式实验前期整套配色方案设计核心逻辑，覆盖仪器适配、抗原分级、配色原则、抗体选择四大核心环节，搭建完整多色流式面板设计流程，大幅减少多色实验分群差、补偿紊乱、信号丢失等问题，降低重复实验成本。
一、充分了解检测仪器
仪器的激光器、滤片组合直接决定荧光素能否被有效激发、稳定检测，共线激光器会大幅限制可用荧光素种类，是配色第一步必须确认的硬件条件。
常见经典/光谱流式仪器
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图注：405nm 紫激光通道
A 检测器：780/60 带通滤片，适配 BV786
B 检测器：710/50 带通滤片，适配 BV711
C 检测器：660/20 带通滤片，适配 BV650
D 检测器：605/40 带通滤片，适配 BV60
E 检测器：525/50 带通滤片，适配 BV510
F 检测器：450/50 带通滤片，适配 BV421
二、抗原表达丰度分级
根据细胞表面 / 胞内抗原表达量分为 3 类，分级直接决定后续亮 / 暗荧光素配对规则：
1. 一级抗原（高表达） 阴阳分群界限清晰，仅存在阳性 / 阴性两种状态，代表标志物：CD3、CD45。
2. 二级抗原（中等表达） 表达量呈连续梯度，无明确阴阳分界，代表标志物：CD45RA、CD45RO。
3. 三级抗原（低表达 / 未知表达量） 信号微弱、阳性群体稀少，代表标志物：FoxP3。
| Principal cell type | Marker | Avg molecules per cell |
| T cell | CD3 | 40,000 |
| Helper T cell | CD4 | 100,000 |
| Cytotoxic T cell | CD8 | 70,000 |
| Platelet | CD9 | 50,000 |
| Myeloid | CD13 | 60,000 |
| Monocyte | CD14 | 150,000 |
| NK cell | CD16 | 50,000 |
| B cell | CD19 | 100,000 |
| B cell | CD20 | 200,000 |
| B cell | CD22 | 100,000 |
| Activated B cell | CD23 | 40,000 |
| Activated T cell | CD25 | 10,000 |
| T cell | CD28 | 40,000 |
| Endothelial | CD31 | 300,000 |
| Myeloid | CD33 | 50,000 |
| Monocyte | CD36 | 70,000 |
| Activated lymphocyte | CD38 | 60,000 |
| B cell | CD40 | 15,000 |
| Platelet | CD41 | 80,000 |
| Platelet | CD42b | 25,000 |
| All leukocytes | CD45 | 700,000 |
| APC/Endothelial | CD54 | 100,000 |
| NK cell | CD56 | 200,000 |
| APC | CD58 | 80,000 |
| Naïve lymphocyte | CD62L | 50,000 |
| Monocyte | CD64 | 20,000 |
| Neutrophil | CD66b | 100,000 |
| Activated T cell | CD69 | 15,000 |
| Proliferative cells | CD71 | 150,000 |
| Endothelial | CD73 | 100,000 |
| APC | CD80 | 15,000 |
| Activated T cell | CD95 | 20,000 |
| Erythroid | CD99 | 60,000 |
| Endothelial | CD102 (ICAM‑2) | 150,000 |
| Endothelial | CD106 (VCAM‑1) | 100,000 |
| Myeloid | CD114 | 50,000 |
| Monocyte | CD115 | 30,000 |
| Hematopoietic progenitor | CD117 | 75,000 |
| Monocyte | CD120 | 7,500 |
| Monocyte | CD121 | 8,000 |
| Activated NK cell | CD122 | 5,000 |
| Lymphocyte | CD132 | 10,000 |
| T cell | CD152 (CTLA‑4) | 15,000 |
| Tumor/APC | CD274 (PD‑L1) | 20,000 |
| Tumor/NK cell | CD276 (B7‑H3) | 60,000 |
| Activated T cell | CD279 (PD‑1) | 30,000 |
| Epithelial tumor | CD326 (EpCAM) | 25,000 |
| Breast tumor | CD340 (HER2) | 600,000 |
| GI epithelium | CEACAM5 (CEA) | 400,000 |
| Epithelial cell | EGFR | 200,000 |
| Neuroblastoma | GD2 | 1,000,000 |
| Melanoma | GD3 | 600,000 |
| Neuroblastoma | GPC2 | 100,000 |
| Epithelial tumor | MUC1 | 400,000 |
| Prostate epithelium | PSMA | 200,000 |
| Epithelial tumor | Trop‑2 | 100,000 |
常见抗原-表达丰度参考
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三、配色原则
1、强弱搭配
高亮度荧光素搭配三级低表达抗原、或稀有细胞亚群；若将弱荧光素标记低丰度抗原，会大幅降低细胞分群分辨率。
弱荧光素搭配高表达抗原，能够减少整套配色的荧光溢散干扰。
常见荧光素相对亮度表
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案例展示
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标注：高亮度荧光素 —— 分群分辨率良好
左图：低丰度抗原搭配弱荧光素（CD25-FITC），实验效果差；
右图：低丰度抗原搭配高亮荧光素（CD25-PE）、高丰度抗原搭配弱荧光素（CD4-FITC），可清晰区分全部细胞亚群。
2、荧光溢漏（Spillover）与共表达标志物规避策略
针对共表达标志物，需选择相互间荧光溢散程度最低的荧光素组合。荧光溢散会增加其他检测通道的光子计数误差（即信号扩散），造成对应通道细胞分群分辨率下降。
建议在配色设计前提前划定圈门策略，可充分预判双阳性细胞群体的分布特征。
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3、细胞自发荧光Autofluorescence（AF）适配方案
若待测细胞自发荧光水平高，需选用信号不易被自发荧光掩盖的荧光素。
四、抗体选择
1、标志物筛选
筛序可精准区分目标细胞亚群的表面 / 胞内标志物
2、克隆号筛选
确认实验优先使用的抗体克隆株，同一标志物不同克隆号抗体结合活性差异极大：
部分克隆无法适配固定、破膜、刺激等细胞前处理；
胞内转录因子（如 FoxP3）、磷酸化蛋白对克隆特异性要求更高；
