巨噬细胞可不是千篇一律的 “免疫清洁工”！其起源谱系多样，极化激活通路繁杂；组织微环境、炎症刺激、细胞代谢共同调控分化命运，各组织驻留巨噬均具备独特表面标志物，功能表型与代谢模式差异显著。
EMP来源和HSC来源的巨噬细胞通过细胞-细胞与特化组织细胞的串扰来促进组织的功能
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巨噬细胞的主要功能和代谢途径
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一、生物学背景
组织修复领域最大难点之一是巨噬细胞高度异质性，传统方法难以精准区分不同功能亚型。本文介绍一套实验方案：先从皮肤创面组织中分离免疫细胞，再借助流式细胞术分选创面巨噬细胞，最后完成单细胞 RNA 测序，可实现单细胞表面蛋白标记与转录组数据一一对应，配套全套试剂配方、流式设门标准、文库质控指标及高频问题解决方案，创伤修复、皮肤炎症、巨噬异质性相关研究可直接复用。
二、实验信息
| 分类 | 详细内容 |
| 样本类型 | 1. 实验样本：8–12 周龄雌雄野生型小鼠全层打孔皮肤创面组织 |
| 2. 取样时间点：伤后 2–4 天（炎症期）、伤后 12–14 天（修复消退期） | |
| 3. 拓展样本：各类皮肤炎症小鼠模型创面组织（皮炎、损伤修复模型） | |
| 方案类型 | STAR Protocols 标准化方法学实验方案；改良微型化 Smart-seq2 单细胞 RNA 测序配套流式索引分选完整操作流程 |
| 流式仪器 | BD FACS Aria II/III 流式细胞分选仪 |
| 细胞类型 | 1. 目标分选细胞：创面巨噬细胞（分群标准：DAPI 阴性活细胞，CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺） |
| 2. 巨噬细分亚群（通过表面标记区分异质性）：Trem2⁺修复型巨噬、CD301b⁺组织驻留巨噬、MHC II⁺抗原呈递炎症巨噬 | |
| 3. 组织杂细胞（分离过程中存在，分选排除）：角质形成细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞（CD3e⁺、NK1.1⁺、B220⁺） |
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实验四大核心阶段：
1. 小鼠皮肤打孔造模（4 mm 活检打孔器制造全层开放创面，术后镇痛、隔离饲养）
2. 创面组织单细胞悬液制备：组织剪碎→Liberase 酶解→机械研磨→过滤、离心、红细胞裂解，获得免疫细胞悬液
3. 流式细胞分选：封闭 Fc 受体→多色荧光抗体标记巨噬表面标志物→DAPI 活死染色；BD 流式分选仪索引分选单颗 CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺巨噬至含裂解液的 384 孔板
4. 改良 Smart-seq2 单细胞转录组测序：细胞裂解→逆转录→cDNA 扩增→磁珠纯化；两种文库构建方案→文库定量、均一混样、片段筛选→上机单细胞 RNA 测序
三、配色方案&数据结果
配色方案
| 标志物 | 荧光染料 | 克隆号 | 标志物意义 |
| CD45 | FITC | 30-F11 | 造血免疫细胞 |
| CD11b | APC-eF780 | M1/70 | 髓系细胞 |
| F4/80 | PE | Cl:A3-1 | 巨噬细胞 |
| Trem2 | APC | 237920 | 修复型创面巨噬 |
| CD301b | PerCP/Cy5.5 | URA-1 | 皮肤驻留 / 修复巨噬亚群 |
| MHC II | eFluor450 | M5/114.15.2 | 抗原呈递分子 |
| FC阻断剂 | 荧光染料 | 克隆号 | 封闭细胞 Fc 受体 |
| L/D | 荧光染料 | 克隆号 | 死活染料 |
流式结果
创面巨噬细胞流式分选的设门策略
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图 A、B 分别为损伤后第 4 天、第 14 天的代表性流式散点图。
首先圈选 DAPI 阴性单细胞（门 G1–G4），检测 CD45 表达；再圈出 CD45 阳性细胞群（门 G5），分析细胞 CD11b 与 F4/80 的表达。
将 CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺单细胞创面巨噬细胞（门 G6）分选至 384 孔板，用于 RNA 测序。
还可进一步检测该群巨噬细胞的 Trem2、CD301b、MHC II 表达。索引分选可在单细胞层面整合流式检测数据与基因表达数据。
小优有妙计
Q：小鼠皮肤组织如何处理成单细胞悬液？
①可参考文献中的方法，取出损伤4天后的创面组织，用手术刀除去创面外围皮肤并切碎组织开展酶解，酶解完成后将组织转入Medicon研磨器匀浆5分钟，最终使用1mL注射器吸取得到单细胞悬液。
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②也可使用小鼠皮肤组织解离试剂盒（CAT:abs50227））配合摇床进行使用
操作流程：
1、对小鼠实施安乐死，在皮毛线以上部位的基部截断耳部；
2、在无菌培养皿表面放置耳组织，使用镊子在组织上划线去除多余毛发，用弯头镊子将耳组织沿背腹方向切开，分成2部分-背侧和腹侧。
3、将皮肤组织（100mg）加入含有解离液200μL的5mL离心管中，用细剪将皮肤组织切成极小碎片，直至形成糊状物；
4、后向离心管中再加入1.8mL组织解离液，涡旋混匀后放入水平摇床中，37℃，120转/分钟，消化90分钟；
5、后向试管中加入40 μL的0.5MEDTA溶液终止消化，涡旋混合后继续孵育10分钟（37℃，120转/分钟）；
6、消化完成后取出离心管，将滤液和破碎组织通过无菌70 μm 细胞筛过滤至新的50mL离心管中，并使用5mL的1xPBS缓冲液（abs962）冲洗装过滤液的离心管并过滤，获得细胞悬液；
7、将细胞悬液在4℃条件下，400×g离心5分钟，弃去上清液。
8、使用适量1xPBS缓冲液重悬细胞沉淀，可以用于后续分析。
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abs50227 小鼠皮肤组织解离试剂盒制备单细胞悬液的流式质控检测结果。经组织消化、活死标记染色后上机分析，样本活细胞比例 93.8%左右，提示样本制备质量良好。
Q: 创面细胞活率低于 70%，RNA 易降解如何进行优化？
实验前预冷离心机、所有缓冲液至 4℃；酶解严格 1 h，每 15 min 手动摇匀；3红细胞裂解孵育不超过 2 min；消化过滤后全程冰上低温操作；提前配好全部试剂，缩短取材至分选间隔时间。
参考文献：
· Isolation of macrophages from mouse skin wounds for single-cell RNA sequencing
· Cell Mol Immunol. 2022 Mar;19(3):384-408.
· Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K. et al. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol 23, 563–579 (2023). https://doi.org/10.1038/s41577-023-00848-y
