IP人最担心的事情发生了——不是CoIP没条带，而是IP没条带！

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是研究蛋白功能、修饰和相互作用的经典实验。新手做IP担心结果看不懂，老手做IP担心IP没条带，今天小优细节君来了，结合大量实操案例，拆解 IP 实验全部高频坑点，从结果判断问题根源，配套抗体选型、磁珠搭配、洗脱洗涤全套优化方案，帮助大家做出可靠可信的实验结果。

 

PART 01

解读IP结果，主要关注3个关键泳道

三者结合，才能得出可靠结论。

· Input泳道：用于确认靶标蛋白在总蛋白中正常表达，同时可以比对IP组的条带。

· IP泳道：（使用特异性抗体）出现目标条带，说明IP成功富集到靶标蛋白，这个条带大部分情况下是比input明显。

· IgG泳道：在目的条带位置无条带，则证明实验特异性好。

 

PART 02

IP常见问题

拆解高频坑点,判断问题根源。

1 轻重链干扰

完整的抗体包含两条重链和两条轻链，抗体变性后会产生一个55kDa的重链蛋白，一条25kDa的轻链蛋白。在WB检测时，如果WB一抗种属和IP抗体种属一致，或者是同一支抗体，那么普通二抗就会结合变性后的一抗轻重链，导致显色时会产生两条对应大小的轻重链。如果恰好我们的目的蛋白也在这两个分子量附近，就会干扰结果解读。那么，我们应该怎样减少或者避免被干扰呢？

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1）选择WB一抗时，选择和IP不同种属的抗体，就避免IP一抗的轻重链干扰；

左图为相同种属的IP和WB一抗；右图为不同种属的IP和WB一抗

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2） 选择特殊二抗：

（1） 选择只识别结合一抗空间表位的特殊二抗，若一抗变性产生了轻链与重链，该二抗无法结合，WB结果也可以避免曝光出两条轻重链；

图A为构象特异二抗，图B为普通二抗

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（2） 如果目的蛋白分子量小于30kDa，选择只识别重链的二抗；如果大于30kDa，选择只识别轻链的二抗；或者选择避免轻重链的二抗 ；

左图为识别轻链二抗，右图为普通二抗

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2 IP组无条带

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这是IP人最担心的事情了，为什么这么说呢，因为CoIP做不好可能是蛋白相互作用不够强，我们换个蛋白再试就行了。如果是IP没条带，说明体系有问题了，整个体系需要重头开始排查。

input

首先看Input，样本的表达情况至关重要，如果input都没有，需要排查表达量和上样量

IP样本投入量

回顾一下IP样本投入量是否足够，推荐500-1000ug

抗体用量

抗体用量是否足够，抗体是否可用于IP应用

上清液

检测洗涤上清液，如果上清液有目的蛋白，说明抗体未能结合目的蛋白，要么是抗体不能结合蛋白，要么是磁珠和抗体结合不好

洗脱条件

如果上清液没有目的蛋白，说明目的蛋白未洗脱，需要优化洗脱条件，高温洗脱或者改变PH。

 

3 IP结果杂带多，背景干扰严重

1）Input与IP组杂带多

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推荐更换特异性更好的抗体，此结果也显示出该抗体虽然可以IP到靶标蛋白，但是富集效果不佳，不适合进行IP实验。

2）IgG组出现目的条带或者其他杂带

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（1） 进行样本预吸附，提前去除样本中会与磁珠/IgG非特异性结合的蛋白；

（2） 优化抗体用量。IgG浓度一般高于IP抗体浓度，在IP实验中，保持两者质量一致，而不是体积一致。

（3） 提高洗涤缓冲液中去污剂浓度或增加洗涤次数；

（4） 如果IgG组的杂带和IP组类似，考虑是beads非特异结合，也可以通过样本预吸附进行去除。

 

写在最后：

以上就是免疫沉淀 IP 实验最常遇到的三类核心问题：抗体轻重链干扰、IP 泳道无靶标条带、杂带背景过高的全套排查与优化方案。想要做出可重复、数据可靠的 IP 实验，核心离不开合格样本前处理、完整对照设置、IP 级抗体与磁珠、标准化洗涤洗脱流程四大关键环节。对照 Input、IP、IgG 三组泳道综合判读结果，逐层排查实验漏洞，就能大幅降低 IP 实验失败概率，高效完成蛋白互作实验。

如果你在做 IP 免疫沉淀时仍遇到 WB 条带异常、富集效率低等实操难题，欢迎在评论区留言你的实验现象，我们一起拆解解决；觉得本文干货实用，不妨点赞、在看分享给实验室小伙伴们。关注小优细节君，持续更新实验避坑干货。

 

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