知识卡片 流式3min
欢迎来到《流式3min·知识卡片》系列！
一张知识卡，搞定一个流式难题。覆盖指标选择、荧光素特性、滴定染色、固定破膜、电压补偿、数据分析等流式高频踩坑环节，减少试错，少走弯路~~
本期聚焦新手最容易忽略、却会影响分群质量的关键步骤 —抗体滴定。
一、为什么要做抗体滴定？
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不少做流式的同学会发现，有时候直接照搬说明书固定抗体用量，可能会出现阴性背景杂乱、阴阳细胞分不开，或者抗体浓度过高，导致非特异性染色干扰较大，还白白消耗昂贵抗体。
抗体滴定作为荧光抗体组合优化中最核心的步骤之一，目的是实现最佳细胞分群分辨率，其核心价值有 三点：
1. 筛选最优工作浓度：让阳性细胞荧光信号最大化，同时压低非特异性背景染色，提升信噪比，细胞分群干净清晰；
2. 节约实验试剂：找到最低有效使用浓度，降低实验成本；
3. 适配多色实验：提前规避高浓度抗体带来的荧光扩散、溢漏干扰，为后续配色、补偿校准打好基础。
二、抗体滴定-染色实验避坑要点
1. 实验体系保持一致：抗体滴定的所有实验条件必须与正式检测保持完全一致（细胞类型、孵育温度、孵育时长、染色体系总体积、细胞总数均统一）。
2. 活死染料必不可少：死细胞容易产生非特异性干扰，不加容易导致数据不可信
3. FC封闭不可省略：滴定实验务必加入 Fc 封闭液，阻断 Fc 受体介导的非特异性结合干扰。
4. 低表达抗原搭配辅助标记：例如异质性组织样本中加入 CD45 标记，筛选出全部白细胞
5. 梯度稀释建议：初始浓度设置为 10 μg/mL，配制 8 组连续 2 倍梯度稀释液。
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注：梯度浓度依次为 10.0 μg/mL、5.00 μg/mL、2.50 μg/mL、1.25 μg/mL，后续持续稀释、
滴定案例
以CD127抗体为例，总质量0.1mg，浓度0.2mg/mL
总体积=0.1mg/0.2mg/mL=0.5mL，每Test使用量=0.5mL/100T=5uL（最大用量）
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(1) 准备6个1.5 mL EP管，在每个管中加入5 μL FACS buffer；
(2) 1号管加入5 μL抗体原液，混匀。换枪头，取5 μL加入下一个管中。以此类推。6号管中的最后5 μL弃去；
(3) 每管中加入100 μL /106个细胞；
(4) 4℃孵育30 min, 1650 rpm离心5min，弃上清。加入200 μL FACS buffer重悬后加入PI，上机检测；
(5) 滴定结果可视化
三、抗体滴定-数据分析避坑要点
1. 每组样本至少采集 1000 个表达目的标志物的活细胞events
2. 标准设门流程：活细胞 → 前向散射光 / 侧向散射光（FSC/SSC） → 单细胞群 → 阳性细胞群、阴性细胞群。
3. 每一组稀释样本都需要重新调整阳性、阴性门边界，不同浓度组的荧光细胞峰位会发生偏移；补充说明：各组样本中阳性细胞占比应基本保持一致。
4. 严禁仅依靠肉眼观察荧光图谱判定最优抗体浓度。
5. 利用阴性、阳性细胞群的中位荧光强度（MFI） 计算每组条件对应的分离指数（SI）；优先选择分离指数数值最高的抗体浓度作为最优浓度；若开展多色流式实验，可在此基础上适当下调抗体浓度，减少荧光信号溢漏扩散。
分离指数计算公式
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纵轴由下至上代表抗体浓度从低到高，US 为未染色对照组；红框标注组别分群效果最优
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纵轴由下至上代表抗体浓度从低到高，US 为未染色对照组；红框标注组别分群效果最优
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曲线峰值对应的浓度即为分离指数最高的最优抗体使用浓度
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小优有妙计
Q：Flowjo如何调用Stain Index？
A:参考如下操作
1、导入样本手动圈出目标群体
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2、选中目标群体调用Stain Index插件
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3、选中相应染色参数
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4、软件自动跳出阴阳群圈门界面（可自行调整）
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5、软件同时自动跳出数据导出界面，选中任意数据点击Create Table，即可自动计算生成每个浓度阴阳群的中值荧光强度（MdFI）以及生成每个浓度阴性群体的标准偏差（SDneg）
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参考文献：
10.4155/bio-2021-0201
https://fccf.mskcc.org
