1.3 肿瘤样本处理与单细胞悬液制备

样本准备

   ● 将新鲜肿瘤样本倒入预先用手术刀刮擦过的塑料培养皿中。

   ● 用 10 mL 注射器的塑料推杆轻轻按压切碎的肿瘤（避免使用橡胶部分）。

过滤与离心

   ● 通过 100 μm 尼龙细胞滤网过滤肿瘤匀浆，用 1 mL 注射器推杆辅助按压，同时将培养基通过滤网以帮助匀浆过滤。

   ● 4℃下以 500×g 离心 5 分钟，吸弃上清以去除碎片和死细胞（所有废液需用至少 10% bleach 处理）。

红细胞裂解

   ● 加入 5-10 mL裂红重悬沉淀，室温旋转孵育 5 分钟（注意：孵育时间过长会降低免疫细胞活力）。

   ● 加入 10 mL R10 培养基终止裂解反应，4℃下以 500×g 离心 5 分钟，吸弃上清。

二次过滤与计数

   ● 用新鲜 R10 培养基重悬沉淀，通过 70 μm 滤网过滤至新的 50 mL 锥形管中。

   ● 用台盼蓝溶液和 Neubauer 计数板计算总活细胞数，同时 4℃下以 500×g 离心 5 分钟。

细胞冷冻

   ● 吸弃上清，用冷冻培养基重悬沉淀（最大密度为 5 mL / 冻存管）。

   ● 将样本放入 Mr. Frosty 冷冻容器，-80℃过夜后转移至液氮罐保存。

 

细胞解冻与洗涤

   ● 37℃水浴中快速解冻一管卵巢肿瘤细胞，轻轻摇晃；解冻后用 70% 乙醇擦拭管外壁，缓慢转移至含 5 mL 预热完全培养基的 15 mL 离心管中，轻轻混匀。

   ● 4℃下以 500×g 离心 5 分钟，吸弃上清，用 5 mL 完全培养基重悬细胞，通过 70 μm 滤网过滤，再用 5 mL 培养基冲洗滤网。

   ● 重复洗涤：4℃下以 500×g 离心 5 分钟，用 5 mL 完全培养基重悬后通过 45 μm 滤网过滤，再用 5 mL 培养基冲洗滤网。

细胞计数与死细胞去除

   ● 4℃下以 500×g 离心 5 分钟，用 5 mL 完全培养基重悬细胞并计数（计数时需将细胞置于冰上）。

   ● 加入死细胞去除试剂盒缓冲液，4℃下以 500×g 离心 5 分钟，重悬沉淀至密度 1×10⁸ cells/mL，按死细胞去除试剂盒说明书操作。

分选缓冲液处理

   ● 将 2.5 mL 富集后的细胞悬液转移至新 15 mL 管，加入 10 mL 分选缓冲液；离心后重悬沉淀，取 aliqu 计数并再次用分选缓冲液洗涤。