1.4 抗体染色与FACS分选

封闭与染色

   ● 用分选缓冲液重悬细胞至 1×10⁶ cells/100 μL，加入 Human FC 阻断剂，室温孵育 10 分钟。

   ● 加入分选抗体（CD45、CD3、CD4、CD8、CD69、CD103），抗体终稀释比例 5:200（提前用分选缓冲液按 5:100 配制抗体混合液），4℃避光孵育 1 小时。

洗涤与过滤

   ● 用分选缓冲液洗涤细胞，重悬至约 5×10⁶ cells/mL；通过 40 μm 滤网过滤以去除团块，加入 DAPI（终浓度 100 ng/mL）。

FACS 分选

   ● 使用 BD FACSAria™ III 细胞分选仪（或 MACSQuant Tytoc），设置 20 psi 压力和 100 μm 喷嘴。

   ● 按层级设置 gates：P1（淋巴细胞，SSC-A/FSC-A）→ P2（单细胞，FSC-H/FSC-A）→ P3（活细胞，DAPI⁻）→ P4（T 细胞，CD45⁺CD3⁺）→ P5（CD8⁺ T 细胞，CD8⁺CD4⁻）→ P6（TRM 细胞，CD69⁺CD103⁺）→ P7（循环 T 细胞，CD69⁺/⁻CD103⁻）🔶2-173🔶。

   ● 用 1.5 mL Eppendorf 管收集分选细胞（管内预先加入过滤后的 FBS），分选后立即处理，避免长时间置于冰上。

 

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常见问题	可能原因	解决方案
某些样本的 T 细胞数量远低于预期	FACS 无法保证所有回收细胞都是 T 细胞，且无法有效回收所有 T 细胞；不同 TILs 样本中 T 细胞比例因样本来源和富集情况而异	在最终分选前，通过流式细胞术分析样本，选择最佳样本
最终回收细胞数与目标数偏差大	细胞浓度计数不准确；细胞浓度过低或过高；细胞异质性；未去除红细胞	用 AO/PI 染色溶液在 cellometer 上计数三次，取平均值；确保细胞浓度合适；必须进行裂红；过滤去除碎片；尽量防止细胞聚集
分选细胞活力快速下降，导致数据质量差	分选时间过长；同时处理样本过多	尽量缩短分选时间