2.3 OVA - 单核细胞增生李斯特菌的制备与小鼠感染

细菌复苏与培养

   1、从 - 80℃取出冻存的 OVA - 李斯特菌，室温融化后，接种至含 5 mg/mL 红霉素的 BHI 培养基，37℃、220 rpm 振荡培养 12 h（激活细菌）。

   2、取 20 μL 激活菌液转接至 2 mL 含红霉素的 BHI 培养基，37℃、220 rpm 继续培养 2.5 h（对数生长期，OD600≈0.35，浓度≈8.4×10⁷ CFU/mL）。

细菌洗涤与浓度调整

   1、培养后的菌液 4℃、2100×g 离心 10 min，弃上清，用 PBS 重悬并重复洗涤 3 次。

   2、调整浓度至1.25×10⁸ CFU/mL（每只小鼠注射 100 μL，即 1.25×10⁷ CFU）。

小鼠尾静脉感染

   1、用固定器固定 8 周龄雌性 C57BL/6N 小鼠，酒精擦拭尾部暴露静脉，注射 100 μL 细菌悬液，注射后按压止血。

   2、感染后小鼠自由摄食饮水，每日观察状态。

 

肝脏取材与匀浆

   1、处死小鼠，取完整肝脏称重，放入无菌匀浆袋，用圆柱形工具充分研磨。

   2、加入 5 mL PBS，经 70 μm 细胞筛过滤，收集肝组织悬液。

稀释与涂布

   1、取 200 μL 肝悬液，在 96 孔板中进行 1:10 系列稀释（至 10⁻⁸）。

   2、取 100 μL 各稀释度菌液，涂布于预温干燥的 BHI 平板（含红霉素），37℃培养 12 h。

计数与计算

   1、选择菌落数 30-300 的平板计数，按公式计算每克肝脏组织的 CFU：CFU/组织=(CFU/0.1 mL×稀释倍数×5mL)/肝脏重量

   2、设置未感染小鼠肝脏和已知菌量对照，排除污染。

 

脾脏单细胞悬液制备

   1、取脾脏剪碎，置于 40 μm 细胞筛上，用 2.5 mL 注射器芯轻柔研磨，加入 0.2% BSA-PBS 冲洗，收集细胞悬液。

   2、400×g 离心 5 min，弃上清，加入 2 mL 红细胞裂解液，室温静置 2 min，再加入 8 mL 0.2% BSA-PBS 终止反应，离心洗涤 2 次。

细胞计数与封闭

   1、调整细胞浓度至 1×10⁷ cells/mL，取 100 μL（1×10⁶ cells）至 1.5 mL 管，加入 0.5 μL TruStain FcX PLUS（抗 CD16/32），冰上孵育 10 min（封闭 Fc 受体）。

表面染色与流式分析

   1、加入 10 μL H-2Kb OVA 四聚体 - PE，室温避光孵育 1 h；再加入 0.625 μL FITC 抗 CD8 抗体和 1.25 μL PE/Cy7 抗 CD44 抗体，冰上避光孵育 20 min。

   2、用0.2% BSA-PBS 洗涤 3 次，加入 5 μL 7-AAD（死细胞标记），避光孵育 5-10 min。

   3、流式细胞仪分析， gated 活细胞（7-AAD⁻）→ CD8⁺ → CD44⁺ → OVA 四聚体⁺细胞（OVA 特异性 CD8⁺T 细胞）。