2.4 脾脏 OVA 特异性 CD8+T 细胞相关细胞因子检测

细胞激活

   1、按 “步骤三” 方法制备脾脏单细胞悬液，调整浓度至 1×10⁷ cells/mL，取 1×10⁶ cells，400×g 离心 5 min。

   2、用 200 μL RPMI 1640 培养基重悬，加入 96 孔板，每孔加 0.4 μL 含 Brefeldin A 的细胞激活 cocktail，37℃、5% CO₂孵育 4 h（激活细胞因子分泌）。

死细胞标记与封闭

   1、收集激活后的细胞，400×g 离心 5 min，用 100 μL Zombie NIR 溶液（不含 BSA）重悬，室温避光孵育 30 min（死细胞标记）。

   2、用0.2% BSA-PBS 洗涤 2 次，加入 0.5 μL TruStain FcX PLUS，冰上孵育 10 min（封闭 Fc 受体）。

表面染色与胞内染色

   1、加入1.25 μL APC 抗 CD8、0.12 μL Alexa Fluor 488 抗 CD4、2.5 μL BV510 抗 CD44 抗体，冰上避光孵育 20 min，洗涤后用 0.5 mL 固定缓冲液室温避光固定 20 min。

   2、用透化缓冲液洗涤 3 次，加入 5 μL PE/Cy7 抗 IFN-γ、5 μL PE 抗 GzmB、1.25 μL BV421 抗 TNF-α、5 μL PerCP/Cy5.5 抗 IL-2 抗体，室温避光孵育 20 min。

   3、透化缓冲液洗涤 2 次，用 0.2% BSA-PBS 重悬，流式细胞仪分析 CD8⁺/CD4⁺T 细胞中细胞因子的表达。

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感染和未感染 OVA - 单核细胞增生李斯特菌的小鼠 T 细胞中 IFN-γ、颗粒酶 B（GzmB）、TNF-α 和 IL-2 的表达图

 

在感染后第 7 天，从感染和未感染 OVA - 单核细胞增生李斯特菌的小鼠中收集脾脏。制备单细胞悬液，用含布雷菲德菌素 A 的细胞激活 cocktail 刺激 4 小时，并用抗小鼠 CD8-APC、CD4-Alexa Fluor 488、CD44-BV510、IFN-γ-PE/Cy7、GzmB-PE、TNF-α-BV421 和 IL-2-PerCP/Cy5.5 抗体进行染色。

(A) IFN-γ、GzmB、TNF-α 和 IL-2 阳性的 CD8⁺ T 细胞或 CD4⁺ T 细胞的 gates 策略。

(B) 感染和未感染 OVA - 单核细胞增生李斯特菌的小鼠 CD8⁺ T 细胞或 CD4⁺ T 细胞中 IFN-γ、GzmB、TNF-α 和 IL-2 的代表性流式细胞术图及百分比。

 

问题	解决方案
细菌剂量致死	预实验确定亚致死剂量（通常1–5×10⁷ CFU）
CFU计数不准	选择30–300菌落/平板，梯度稀释验证
四聚体阳性率低	保证≥60万细胞上机，优化抗体浓度
流式管路堵塞	细胞悬液过40μm滤网