3.1 Human Tc和NK细胞的颗粒胞吐及颗粒酶B递送实验思路框架

评估人类 CD8⁺T 细胞和 NK 细胞的颗粒胞吐作用及颗粒酶 B（GZB）传递能力

1、效应细胞（CD8⁺T 细胞、NK 细胞）的脱颗粒（CD107a 表面表达）；

2、GZB 在靶细胞内的传递及活性；

3、重定向杀伤实验中 CD8⁺T 细胞的细胞毒性潜力；

4、NK 细胞的体外细胞毒性。

1、效应细胞：

   - CD8⁺T 细胞：健康人外周血单个核细胞（PBMC），经磁珠阴性选择分离；

   - NK 细胞：健康人 PBMC
2、靶细胞：

   - 小鼠淋巴瘤细胞系 L1210-FAS⁻（用于 CD8⁺T 细胞的重定向杀伤实验）；

   - 人髓系白血病细胞系 K562（用于 NK 细胞的体外细胞毒性实验）。

通过密度梯度离心分离人PBMC，经磁珠分选获取CD8 T细胞（或直接使用PBMC中的NK细胞），体外多克隆扩增CD8 T细胞后，与经CellTrace Far Red标记及生物素-链霉亲和素桥接的靶细胞（L1210-FAS⁻用于CD8 T细胞，K562用于NK细胞）按优化比例共培养，同步加入颗粒酶B底物（GranToxiLux）和CD107a抗体，通过流式细胞术同步检测靶细胞内颗粒酶B活性及效应细胞脱颗粒。

1、共培养条件：效应细胞与靶细胞比例（E:T）需针对不同细胞类型优化

2、流式检测：样本需在 1h 内完成检测，防止 GZB 底物信号淬灭。