3.3 效应细胞&靶细胞制备

1、CD8 T 细胞分离与扩增

   PBMC 分离：

      ● 取 30 mL EDTA 抗凝全血，用 Ficoll 密度梯度离心（400×g, 30 min, 25°C）分离 PBMC。

      ● 洗涤细胞（526×g, 6 min, 4°C），AO/PI 染色计数活细胞。

   CD8 T 细胞分选：

      ● 通过磁珠阴性分选从 PBMC 中分离 CD8 T 细胞。

   体外扩增：

      ● 用抗 CD3/CD28 抗体包被培养板（10 μg/mL 抗 CD3 + 5 μg/mL 抗 CD28）。

      ● 接种 CD8 T 细胞（2×10⁶细胞 / 孔），培养 3 天后转移至新板，添加 IL-2（25 U/mL）继续培养 7-10 天。

   2、NK 细胞（直接使用 PBMC）

      ● 新鲜分离或冻存复苏的 PBMC，静置 14-16 小时后直接用于杀伤实验。

 

1、靶细胞系

   ● L1210-FAS⁻（用于 CD8 T 细胞杀伤实验）

   ● K562（用于 NK 细胞杀伤实验）

2、靶细胞标记

   ● CellTrace™ Far Red (CTFR) 染色：L1210-FAS⁻用 0.1 μM CTFR（K562 用 0.15 μM），37°C 孵育 8 分钟。用冷 FBS 终止反应，洗涤后调整浓度至 5×10⁶细胞 /mL。

   ● 生物素化与链霉亲和素包被（仅 L1210）：用 0.2 mM Biotin-X-NHS 冰上孵育 30 分钟。洗涤后加 20 μg/mL 链霉亲和素，室温孵育 30 分钟。