4.1 Human HIV 抗原特异性 CD8+T 细胞杀伤及胞内流式实验思路框架

3.4 CD8+T 细胞和 NK 细胞的颗粒胞吐作用及颗粒酶 B（GZB）传递能力测定 | 4.2 Human HIV 抗原特异性 CD8+T 细胞杀伤及胞内流式实验所需材料清单

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实验步骤

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实验目的

评估人类 HIV 抗原特异性 CD8 T 细胞的杀伤能力及功能表型，包括通过流式细胞术量化其对靶细胞的杀伤作用，结合细胞内细胞因子染色（ICS）分析其细胞因子产生能力，探究 CD8 T 细胞介导的抗 HIV 免疫机制
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样本来源

1、效应细胞：接受抗逆转录病毒治疗（ART）的 HIV 患者的外周血单个核细胞（PBMC），经 HIV 肽体外扩增获得的 HIV 特异性 CD8 T 细胞；

2、靶细胞：同一 HIV 患者的自体 CD4 T 细胞（从新解冻的 PBMC 中分离）
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样本处理

● 从接受抗逆转录病毒治疗的 HIV 患者中获取外周血单个核细胞（PBMC），经 HIV 肽体外培养 13 天扩增抗原特异性 CD8 T 细胞，期间进行半换液；

● 第 12 天分离自体 CD4 T 细胞并培养，同时检测 CD8 T 细胞中抗原特异性细胞频率；

● 第 13 天分离 CD8 T 细胞，设置胞内细胞因子染色实验，将 CD4 T 细胞用不同浓度 CTV 标记（一组加载 HIV 肽作为靶细胞），与 CD8 T 细胞共培养后，通过流式细胞术分析杀伤能力及细胞因子表达。
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实验难度评估

1、细胞数量控制关键：CD8 T 细胞初始数量需足够，CD4 靶细胞需保证 CTVhigh 和 CTVlow 的 1:1 比例，否则影响杀伤效率计算。

2、共培养比例计算复杂，需提前用 Excel 模板设计，避免稀释错误；ICS 实验需确保添加 Monensin 和 Brefeldin A，否则细胞因子会分泌到上清，无法通过胞内染色检测。