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4.2 Human HIV 抗原特异性 CD8+T 细胞杀伤及胞内流式实验所需材料清单

4.1 Human HIV 抗原特异性 CD8+T 细胞杀伤及胞内流式实验思路框架 | 4.3 HLA 分型和 抗原特异性 CD8+T 细胞培养扩增

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 1

    实验室耗材

    产品名称 品牌 / 型号 / 货号 用途
    细胞培养瓶 Absin(#abs7010) 用于 PBMC 培养及 GITR-L 包被,支持抗原呈递细胞附着以促进 CD8 T 细胞增殖
    流式管 Absin(#abs7303) 用于细胞洗涤、离心及转移
    96 孔 v 型底板 Absin(#abs7038) 用于细胞染色(如四聚体染色、表面染色)及上清处理
    96 孔圆底板 Absin(#abs7060) 用于 ICS 实验设置及效应细胞(CD8 T 细胞)与靶细胞(CD4 T 细胞)共培养
    10 mL 移液管 Absin(#abs7053) 用于收集培养的 PBMC 及转移培养基
    Transfer pipette 通用 用于解冻细胞时添加血清
    血细胞计数板 通用 用于细胞计数
    低温冷冻管(cryovials) 通用 用于冻存细胞
    Human CD8+ T Cell Isolation Kit Miltenyi (#130-096-495 分离扩增后的 CD8 T 细胞
    Human CD4+ T Cell Isolation Kit Miltenyi (#130-096-533 分离自体 CD4 T 细胞作为靶细胞

     

  • 2

    试剂与缓冲液

    产品名称 品牌 / 型号 / 货号 用途
    RPMI 培养基 Absin(#abs9484) 细胞培养基础培养基
    热灭活胎牛血清(FCS) Absin(#abs983) 用于配制 RF10 培养基及 FACSwash,提供细胞营养
    青霉素 / 链霉素 / 谷氨酰胺(PSG) Absin (#abs9244) 添加到 RF10 培养基,防止细胞污染
    RF10 培养基 RPMI+10%FCS+PSG 用于 PBMC 解冻、洗涤及细胞培养
    RF10+ralt 培养基 RPMI+1μM raltegravir 含 HIV 整合酶抑制剂,用于 PBMC 培养及 CD4 T 细胞复苏
    PBS Absin(#abs962) 用于细胞洗涤、配制缓冲液及染色液
    细胞染色缓冲液 Absin(#abs9475) 用于流式细胞术相关的细胞洗涤
    4%多聚甲醛(通用型组织固定液) Absin(#abs9179) 用于固定细胞,保存样本供流式检测
    DMSO Absin(#abs9187) 溶解 CellTrace Violet 及作为 GITR-L 的溶剂对照
    CellTrace Violet(CTV)细胞增殖试剂盒 Thermo Fisher Scientific,#C34557 标记 CD4 靶细胞(低浓度标记肽脉冲细胞,高浓度标记未脉冲细胞)
    拉替拉韦(raltegravir) Merck & Company, Inc.,Cat# 11680 HIV 整合酶抑制剂,添加到培养基抑制病毒复制
    刺激阻断 BD(#550583 刺激并阻止细胞因子分泌,用于 ICS 实验保留胞内细胞因子
    HIV B - 亚型表位肽(如 SLYNTVATL、ILKEPVHGV 等) GenScript 刺激 HIV 特异性 CD8 T 细胞扩增及靶细胞脉冲
    链霉亲和素 - PE(SAPE) Absin(#abs44076218 用于折叠 HLA: 肽四聚体,标记抗原特异性 CD8 T 细胞
    7-AAD 死活染色液 BD(#559925) 标记死细胞,排除非活细胞干扰(流式分析)
    死活染料 BD(#565388) 固定后死细胞染色(T 细胞功能检测)
    转录因子缓冲液套装 BD(#562574) 用于细胞内细胞因子染色的固定和通透
    生物素化 HLA: 肽单体(如 A2-SL9、A3-KK9 等) Peter Doherty Institute for Infection and Immunity 用于制备四聚体,识别抗原特异性 CD8 T 细胞

     

  • 3

    抗体与细胞因子

    产品名称 品牌 / 型号 / 货号 用途
    PerCP Cy5 抗人 CD45RA BD(#757395) 表面染色,识别 CD45RA 表达的细胞亚群
    Alexa Fluor 700 抗人 CD3 BD(#561805) 表面染色,标记 T 细胞
    Brilliant Violet 786抗人 CD3 BD(#566782) 表面染色,标记 T 细胞(多色流式检测)
    RB780 抗人 CD62L BD(#569211) 表面染色,识别淋巴细胞归巢受体
    Brilliant Violet 711 抗人 CD357(GITR) BD(#747662) 表面染色,检测 GITR 表达
    Brilliant Violet 421 抗人 Tim-3 BD(#565562) 表面染色,检测 Tim-3 表达
    FITC 抗人 / 鼠 Granzyme B BD(#560211) 细胞内染色,检测颗粒酶 B 表达
    BD Pharmingen Alexa Fluor 700 鼠抗人 CD3 BD(#561805) 表面染色,标记 T 细胞
    BD Horizon BUV395 鼠抗人 CD4 BD(#742738) 表面染色,标记 CD4 靶细胞
    BD Horizon BUV737 鼠抗人 CD4 BD(#748714) 表面染色,标记 CD4 靶细胞(多色流式检测)
    BD OptiBuild BUV661 鼠抗人 CD279(PD-1) BD(#750260) 表面染色,检测 PD-1 表达
    BD Horizon BUV737 鼠抗人 CD8 BD(#612755) 表面染色,标记 CD8 T 细胞
    BD OptiBuild BUV805 鼠抗人 CD8 BD(#749366) 表面染色,标记 CD8 T 细胞(多色流式检测)
    BD human CD8 PerCP-CyTM5.5 BD(#560662) 表面染色,标记 CD8 T 细胞
    BD Horizon BUV395 鼠抗人 IFN-γ BD(#563563) 细胞内染色,检测 IFN-γ 表达
    BD Pharmingen Alexa Fluor 700 鼠抗人 TNF BD(#561023) 细胞内染色,检测 TNF 表达
    BD Human BD Fc Block BD(#564219) 阻断 Fc 受体,减少非特异性染色
    抗 CD107a-APC 抗体 BD(#560664) 表面染色,检测 CD8 T 细胞脱颗粒活性
    重组人 IL-2 UA BIOSCIENCE(#UA040200
    添加到培养基,促进 T 细胞增殖