4.4 杀伤实验及胞内细胞因子染色分析

1、自体 CD4 T 细胞分离与 CD8 T 细胞四聚体阳性率分析（第 12 天）

   ● 第 12 天解冻同一供体的新 PBMC aliquots，分离 CD4⁺T 细胞，洗涤后重悬，在培养箱中静置 12-15h，作为杀伤试验中的靶细胞群。

   ● 同时，对细胞培养物中四聚体⁺CD8⁺T 细胞的频率进行流式细胞术分析，包括染色、洗涤、固定等步骤，计算活的总 CD8⁺T 细胞中四聚体⁺频率，以确定效应物：靶标培养比率。

2、第 13 天：杀伤试验和细胞内细胞因子染色

   ● Person A 操作：收获扩增的 CD8 T 细胞并分离纯化，设置 ICS 实验，用特异性肽再刺激 CD8 T 细胞，同时加入 Monensin、Brefeldin A 及抗 CD107a 抗体，孵育 6 h。

   ● Person B 操作：处理 CD4 靶细胞，将其分为两部分，分别用高、低浓度 CellTrace Violet（CTV）标记，低浓度标记的 CD4 细胞进行肽脉冲（模拟 “HIV 感染” 靶细胞）；随后将效应细胞（CD8 T 细胞）与靶细胞（CTV 高未脉冲、CTV 低肽脉冲 CD4 细胞）按不同比例共培养 4 h，评估杀伤能力。

 

● ICS 实验中，对再刺激后的 CD8 T 细胞进行活 / 死染色、四聚体染色、表面标志物染色及细胞内细胞因子（如 IFN-γ、TNF 等）染色；杀伤实验中，对共培养细胞进行活 / 死染色和表面标志物染色，最终通过流式细胞术获取数据并分析。

● 特异性裂解能力计算公式为：特异性裂解 = 100-[(存在效应细胞时的 CTV 低 / CTV 高)/(不存在效应细胞时仅含靶细胞的三个孔的平均值的 CTV 低 / CTV 高)×100]。

 

● CD8 四聚体⁺细胞数量少：选择基线时有四聚体⁺细胞群的供体，尝试不同的肽浓度优化细胞扩增，必要时修改杀伤试验的细胞输入。

● 细胞损失：了解进行试验所需的细胞数量，反向计算所需的细胞数量，考虑细胞损失，通过预试验估计细胞损失百分比。

● 细胞计算和稀释步骤问题：开始试验前准备 Excel 表格记录细胞数量、计数步骤和频率，并添加自动公式计算共培养所需的稀释步骤。

● CD4⁺CTV 高：CD4⁺CTV 低细胞混合比例不达标：确保有 3 个孔仅含 CD4⁺细胞的混合液，据此确定比例并作为整个试验的参考点，在共培养前立即混合，若放置过久需重新计数。

● ICS 试验重新刺激问题：保留共培养上清液并冷冻保存，以便后续测量上清液中的细胞因子。