1.3 MACS分选步骤Protocol

​1、PBMC重悬​

• 离心获取PBMC沉淀（300 × g，10 min，RT）
• 按比例重悬：每10⁸细胞用300 μl ​MACS缓冲液​（含0.5% FCS + 2 mM EDTA）
• 示例：3×10⁹细胞 → 9 ml缓冲液

2、阻断与标记​

• 加入 ​FcR阻断剂​（100 μl/10⁸细胞）
• 加入 ​DC分选抗体cocktail​（100 μl/10⁸细胞）
• 关键控制​：4℃孵育10分钟（避免非特异性结合）

1、预冷处理​

• 提前将LS分选柱和磁铁适配器置于4℃冷却

2、柱子活化​

• 将LS柱插入MACS磁铁
• 用3 ml预冷MACS缓冲液冲洗柱子（弃去流出液）
• 柱子规格：最大载量2×10⁹细胞（可分离10⁷标记细胞）

1、上样准备​

• 标记后细胞用PBS洗涤（300 × g，10 min）
• 重悬浓度：500 μl MACS缓冲液/10⁸细胞

2、分级过柱

步骤	操作	目的
首次过柱	细胞悬液加入活化柱	捕获非DC细胞
二次富集	收集流穿液→重过原柱	提高DC纯度
最终洗涤	3 ml缓冲液洗柱×2次	回收残留DC
​DC位置​：流穿液即为目标DC群体

 

3、细胞收集​

• 合并所有流穿液
• 离心沉淀（300 × g，10 min）
• 重悬计数用于下游实验

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1、抗体染色​

• 取10⁵细胞，400 × g离心5 min
• 阻断：加1 μl正常鼠血清（RT，10 min）
• 四色抗体组合：
  • 阳性标志：HLA-DR-PE（验证DC）
  • 阴性标志：  

  - CD14-FITC（排除单核细胞）    

   - CD19-FITC（排除B细胞）     

  - TCRαβ-FITC（排除T细胞）

  2、流式设置​​

  • 避光染色（RT，20 min）
  • 洗涤：10× PBS体积（400 × g，5 min）
  • 重悬：500 μl PBS上机

  3、典型DC表型​

  

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  ✅ HLA-DRʰⁱᵍʰ

  ❌ CD14⁻/CD19⁻/TCRαβ⁻

  附加标志：CD1a⁺/CD86⁺/CD83ˡᵒʷ

4、关键操作要点

风险环节	控制措施
细胞沉淀困难	稀释样本1:4 PBS后重复离心
柱效下降	严格4℃预冷分选柱
抗体非特异结合	FcR阻断剂+冰上操作
DC活性损失	MACS缓冲液全程冰浴
注：完整流程耗时约3小时，DC得率约0.1-0.5% PBMC（文献实测数据）