3.3.1 单核细胞分离，DC获取

1、PBMC分离​

• 将人外周血与密度梯度介质（如Lymphoprep）按1:2.5稀释。
• 离心（800 × g，30分钟，无刹车），吸取白细胞层。
• PBS洗涤3次（300 × g，5分钟）。

2、单核细胞分选​

• 使用Human CD14⁺ Isolation Kit（如Miltenyi Biotec），按说明书用CD14微珠标记细胞。
• 过LS 柱，收集阴性流穿液（含单核细胞）。
• 细胞计数备用。

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Mo-DC可以通过各种手动或者自动的操作步骤获取。在这里以6孔板为例进行说明。

（1）第0天：单核细胞的体外培养

a：计数3×10⁶个单核细胞并添加3mL完全培养基（RPMI 1640、2 mM L-谷氨酰胺，1％自体血清）体外培养，同时补充^7.8250 IU / mL IL-4和800 IU / mL GM-CSF。

b：将接种的细胞放在37°C、5％CO₂的培养箱中孵育2天。

 

（2）第2天：刺激 

将细胞重悬于1.5 mL完全培养基中，再补充2倍浓度的IL-4和GM-CSF刺激，然后放回培养箱中孵育。 

（3）第6天：刺激

a: 再次去除细胞中的培养基。

b: 将细胞重悬于1.5 mL的培养基中，并添加 2000 IU / mL IL-6、400 IU / mLIL-1β，2000 IU / mL TNF-α和2μg/ mL PGE 2进行刺激。

c: 将重悬的细胞放回培养箱再培养24小时。

 

（4）第7天：Mo-DC评估

利用流式细胞仪中的物理光信号和PI的荧光评估成熟Mo-DC（mMo-DC）的活力，得率和细胞比例。