4.2 Mo-DC的分化和成熟

4.1 单核细胞分选和鉴定 | 4.3 CD4+T细胞的分选

Mo-DC可以通过各种手动或者自动的操作步骤获取。在这里我们以6孔板为例进行说明

实验步骤

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第0天：单核细胞的体外培养

a：计数3×10⁶个单核细胞并添加3mL完全培养基（RPMI 1640、2 mM L-谷氨酰胺，1％自体血清）体外培养，同时补充^7.8250 IU / mL IL-4和800 IU / mL GM-CSF。

b：将接种的细胞放在37°C、5％CO₂的培养箱中孵育2天。
2

第2天：刺激

将细胞重悬于1.5 mL完全培养基中，再补充2倍浓度的IL-4和GM-CSF刺激，然后放回培养箱中孵育。
3

第6天：刺激

a: 再次去除细胞中的培养基。

b: 将细胞重悬于1.5 mL的培养基中，并添加 2000 IU / mL IL-6、400 IU / mLIL-1β，2000 IU / mL TNF-α和2μg/ mL PGE 2进行刺激。

c: 将重悬的细胞放回培养箱再培养24小时。
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第7天：Mo-DC评估

a: 再次去除细胞中的培养基。

b: 将细胞重悬于1.5 mL的培养基中，并添加 2000 IU / mL IL-6、400 IU / mLIL-1β，2000 IU / mL TNF-α和2μg/ mL PGE 2进行刺激。

c: 将重悬的细胞放回培养箱再培养24小时

d:利用流式细胞仪中的物理光信号和PI的荧光评估成熟Mo-DC（mMo-DC）的活力，得率和细胞比例。
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圈门逻辑

图注：Mo-DC的产生

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图中显示了使用6孔板实验方案（n = 18）诱导产生的mMo-DC活性和得率（即相对于初始单核细胞计数而言的mMo-DC计数）。利用MACSQuant®Analyzer 10流式细胞仪按照圈门逻辑获得数据：根据物理散射光圈中目的细胞。随后通过PI荧光将死细胞排除并评估mMo-DC的活力为95.4±2.4％。基于刚开始接种的单核细胞数量计算的得到mMo-DCs的得率为23％。