4.4 MLR试验中T细胞活化能力的分析

（1）上个步骤获得的CD4+T细胞进行细胞计数

（2）确定分离细胞的纯度，用CD4-PE或CD45RO-APC和CD45 RA-PE抗体标记细胞，并通过流式细胞仪进行分析。

（3）将5×10⁶个分选纯化的CD4+ T细胞悬浮在400μL PBS中。

（4）室温下，用浓度为10μM CellTrace™ Violet 的溶液100μL孵育细胞5分钟。

（5）用1 mL FCS洗涤细胞一次，并用2 mL MLR培养基（RPMI 1640、2 mM L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，0.1 mM丙酮酸钠，5％人AB血清）洗涤细胞三次。

（6）将CD4+ T细胞重悬于MLR培养基中，细胞密度为5×10⁵个/ mL。

（7）用MLR培养基以1×10⁶个/mL浓度重悬单核细胞、imMo-DC和mMo-DC，并根据下表进行连续稀释。

（8）吸取每种细胞悬液100 µL到96孔板中。

（9）向每个孔中加入100 µL标记的T细胞悬液，并在37°C、5％CO₂培养箱中培养7天。

（10）通过流式细胞仪测量CellTrace™ Violet的荧光来确定CD4+ T细胞的增殖能力。通过物理散射光和PI荧光从分析中排除细胞碎片和死细胞的影响。

 

用于MLR分析的Mo-DC /单核细胞的系列稀释液

Mo-DC /单核细胞密度（细胞/ mL）	每个孔的Mo-DC /单核细胞数	Mo-DC /单核细胞与T细胞的比例（T细胞的数量恒定为50,000）
2.5×10 5	25,000	1：2
1.25×10 5	12,500	1：4
6.25×10 4	6,250	1：8
3.13×10 4	3,125	1: 16
1.56×10 4	1,562	1: 32
7.81×10 3	781	1: 64

 

通过细胞计数T细胞数目发现，与单核细胞相比，imMo-DC和mMo-DC都促进了培养物中CellTrace™ Violet阴性T细胞的增殖。当将mMo-DC用作抗原呈递细胞时，T细胞增殖最高，这与免疫表型的结果一致，其中免疫表型表明参与T细胞启动的受体在Mo-DC上成熟后上调。

图注：Mo-DCs诱导T细胞增殖。

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（A）使用MACS技术从PBMC中分选初级CD4+ T细胞。分离的细胞用CD4-PE或CD45RA-PE/ CD45RO-APC抗体染色，并使用MACSQuantAnalyzer®10流式细胞仪进行分析。

（B）分离的初级T细胞用CellTrace™ Violet标记并通过流式细胞术进行分析。

（C）CellTrace™ Violet标记的初级T细胞、单核细胞、imMo-DC和mMo-DC以16：1的比例共培养7 d，并通过流式细胞仪进行分析。

（D）将初级T细胞与imMo-DC和mMo-DC以不同比例共培养，7天后，通过流式细胞术来确定T细胞的数目。通过PI荧光将死细胞从分析中排除。