4.5 细胞因子分泌分析

一般而言，DC具有分泌促炎和免疫调节因子的能力，这取决于它所接受的刺激。T细胞介导的CD40L刺激Mo-DCs可诱导产生极化的Th1 分泌IL-12，同时也可诱导免疫抑制性IL-10^12-14的分泌。然而，对于癌症治疗发展的研究，我们希望产生分泌大量IL-12和少量IL-10的Mo-DC人群，因为这些细胞通过诱导TH1细胞产生更有效的抗肿瘤反应。

可以在各种条件下刺激Mo-DC以确定它们分泌IL-12和IL-10的能力；也可以将它们与可溶性的人来源CD40-配体孵育，这样可以在体外形成多聚体；也可以与表达CD40L的J558L细胞系共培养。

（1）用RPMI 1640培养基重悬mMo-DC细胞，密度为5×106个/mL，其中培养基中添加2 mM L-谷氨酰胺和1％自体血清

（2）向96孔板的每个孔中接种5×10⁵个细胞。

（3）向每个孔中加入16 µg / mL人CD40-配体以刺激mMo-DC。为了进行比较，将mMo-DC与表达CD40L的J558L细胞系以不同的密度（7×10⁴、14×10⁴或28×10⁴细胞/每孔）共培养。

（4）Mo-DC在37°C，5％CO2培养箱中孵育24小时。

（5）收集细胞上清液，并以300×g离心10分钟以去除其他细胞。

（6）通过特定的ELISA（eBioscience）确定IL-12p70和IL-10的浓度。

 

可溶性CD40L刺激Mo-DCs可产生高水平的IL-12和低水平的IL-10，Mo-DCs与表达CD40L的J588L细胞共培养后，IL-12和IL-10的分泌量总体增加。然而，可溶性CD40L刺激后的IL12 / IL-10的比例高于与细胞系共培养后的比例。因此，与CD40L转染的细胞系相比，重组人CD40L多聚体是一种更优的选择，可以在特定条件下刺激Mo-DCs。

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图注：CD40L刺激后，mMo-DC分泌IL-12和IL-10的能力。

 

（A）在不存在或存在可溶性CD40L（16μg/ mL）或表达CD40L的J558细胞系（7×10⁴、 14×10⁴、28×10⁴个细胞/孔）的情况下，将mMo-DC培养24小时。采用ELISA法测定培养上清液中IL-12p70和IL-10的浓度。

（B） IL-12p70与IL-10的比值是根据(A)的结果计算的。

 

单核和T细胞的分选	CD14 MicroBeads, human (# 130-050-201)
	CD4 MicroBeads, human(#130-045-101)
	Pre-Separation Filters, 30 μm (# 130-041-407)
	MACS Columns and MACS Separators
MO-DC的诱导条件	重组细胞因子Human GM-CSF,
	重组细胞因子Human IL-1β
	重组细胞因子Human IL-4
	重组细胞因子Human IL-6
	重组细胞因子Human TNF-α
	Human PGE2；
	PMRI基本培养基+TexMACS培养基
流式鉴定流式抗体	CD11C, CD80, CD86, CD83, HLA-DR, CD14, CD4, CD209, CD197