1.3 MACS细胞分选步骤

样本：

骨髓单核细胞（来源：小鼠股骨/胫骨骨髓，经ACK裂解去除红细胞）

试剂：

a）Miltenyi #130-100-629（含生物素抗体混合物、抗生物素微珠）

b）MACS分选缓冲液（含0.5% BSA的PBS，预冷至4°C）

c）MACS多联磁架（Miltenyi #130-042-303）

d）LC分选柱（Miltenyi #130-042-401）

设备：

a）MiniMACS/MidiMACS分选器（磁架）

b）离心机（4°C预冷）

A、骨髓细胞的制备

1、使用注射器和26G针头，通过缓冲液冲洗骨髓腔，从股骨（和胫骨）中收集小鼠骨髓细胞。

2、轻轻吹打细胞数次以使其分散。

3、将细胞通过30μm尼龙网过滤，以去除可能堵塞柱子的细胞团块。使用前用缓冲液湿润过滤器。

4、加入缓冲液洗涤细胞，在2–8°C下以300×g离心10分钟。彻底吸去上清液。

5、用缓冲液重悬细胞沉淀，并取出一份进行细胞计数。

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B、单核细胞的分离

1、骨髓分离后，使用单核细胞分离试剂盒（Miltenyi）按照制造商的说明通过阴性选择富集单核细胞，具体步骤如下。

C、磁性标记

1、确定细胞数量。

2、以300×g的离心力离心细胞悬液10分钟。彻底吸弃上清液。

3、每5×10⁷个总细胞，用175μL缓冲液重悬细胞沉淀。

4、加入25μL Fc受体封闭试剂。充分混匀。

5、每5×10⁷个总细胞，加入50μL单核细胞生物素抗体混合物。

6、充分混匀，在冰箱（2-8°C）中孵育5分钟。

7、洗涤细胞：每5×10⁷个细胞加入10mL缓冲液，以300×g的离心力离心10分钟。彻底吸弃上清液。

8、每5×10⁷个细胞，用400μL缓冲液重悬细胞沉淀。

9、每5×10⁷个总细胞，加入100μL抗生物素微珠。

10、充分混匀，在冰箱（2-8°C）中孵育10分钟。

11、进行磁分离操作（参见2.3部分）。

 

D、使用LS柱进行磁分离

1、将柱子放入合适的MACS分离器的磁场中。详情参见相应的MACS柱数据表。

2、用3 mL缓冲液冲洗柱子，做好准备。

3、将细胞悬液加到柱子上。收集含有未标记细胞的流出液，这些未标记细胞代表富集的单核细胞。

4、用3×3 mL缓冲液洗涤柱子。收集通过柱子的未标记细胞（代表富集的单核细胞），并与步骤3的流出液合并。

▲ 注意：仅当柱储液器为空时，才添加缓冲液等分试样进行洗涤步骤。

5、（可选）将柱子从分离器上取下，放在合适的收集管上。向柱子中加入5 mL缓冲液。立即通过用力将柱塞推入柱子中，将磁性标记的非单核细胞冲洗出来。

 

E、单核细胞的培养

分离出的单核细胞可在补充了5 ng/ml重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和2.5 ng/ml重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）的巨噬细胞培养基中培养长达5天。单核细胞应以1×10⁶个细胞的密度接种在非组织培养处理的6孔板中，最终体积为2 ml。

如有需要，可在第5天通过分选Ly6C阳性、F4/80阴性、MHCII阴性和CD11c阴性的细胞，从第5天的培养物中富集单核细胞。