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实验流程workflow
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调整细胞密度
根据细胞生长状态和形态取 2~4 代细胞进行实验。收集形态典型、生长状态良好的 THP-1 进行实验，THP-1 细胞呈单个圆形悬浮，密度约 (5~10)×10⁶/ml，分布均匀，折光度较好。
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培养&观察
THP-1 细胞使用含有 10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺、1% 双抗 (青霉素和链霉素) 配制的 1640 培养基（abs9484），在 37℃、5% CO₂的细胞培养箱内培养，每 12~16h 观察一次。
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设置阴性对照孔
待细胞到达对数生长期时 (培养约 24~36h 后)，用 1640 培养基(abs9484)调整细胞浓度为 6×10⁵个 / 孔接种于 6 孔板中，加入 PMA，调整 PMA 最终浓度依次为 0、10、20、50、100、200ng/ml，最后补充 1640 培养基至 2ml，以 0ng/ml PMA 孔作为阴性对照孔。
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确定PMA优化浓度
培养 24h 后观察各孔细胞贴壁、形态变化情况并摄影。当细胞形态由单个圆形悬浮细胞，逐渐变为贴壁、形态不规则并伸出伪足，综合观察比较各孔分化形态和分化比例，以确定 PMA 诱导 THP-1 分化的优化浓度，以分化细胞比例大的和巨噬细胞形态典型的为优。
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确定PMA优化作用时间
确定最优 PMA 浓度后，使用此 PMA 浓度分别诱导 THP-1 细胞 0、24、48、60h 后再次观察各孔细胞形态变化并摄影，综合观察比较各孔分化形态和分化比例，以确定 PMA 诱导 THP-1 分化的优化作用时间，其中 0 作用孔作为阴性对照孔。细胞培养严格无菌操作，若有污染则弃去细胞，重新复苏。
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巨噬细胞极化&检测
将成熟的巨噬细胞消化下来（Accutase酶，561527），重新铺板，以下两种极化方式诱导向M1、M2的极化：刺激48小时后，用流式的方法检测极化后M1 (CD86,756991) 等、M2 (CD206,753601) 标志蛋白的表达
M1巨噬细胞极化条件 20 ng/ml的IFN-y和10 pg/ml的LPS孵育24小时 M2巨噬细胞极化条件 20 ng/ml的IL-4和20 ng/ml的IL-13处理M0巨细胞24至72小时。
延长孵育时间(48-72小时)往往会增加M2标记物如CD206、IL-10和CCL18的表达注意事项 定期观察细胞形态和活力，根据需要调整培养条件以维持最佳生长和分化 说明1 M1诱导是比较稳定的，CD86表达85%以上，CD86的极化程度和LPS浓度相关 说明2 M2比较难诱导，比例10%左右，文献报道，降低PMA的浓度、M0后静息，有利于M2方向诱导