2.2 Monocyte Derived Macrophage 单核细胞的诱导分化

2.1 THP-1极化 | 2.3 骨髓来源巨噬细胞BMDM的诱导分化

视频素材来源于JOVE https://app.jove.com/v/61807/polarization-m1-m2-human-monocyte-derived-cells-analysis-with-flow

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实验流程workflow

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PBMC分离

在无菌条件下，从全血中分离 PBMC。
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培养基配置与细胞接种

1、RPMI1640 完全培养基的配制：加入胎牛血清（abs983）（最终浓度达 10%）和 2mM 左旋谷氨酰胺到 RPMI1640 培养基（abs9484）。使培养基的温度达到 37°C。可选：添加 1% 的青霉素 - 链霉素（5000 单位 /mL）

2、重悬细胞于 RPMI1640 完全培养基中，使细胞浓度达 2×10⁶个细胞 /mL。

3、将细胞溶液转移到细胞培养皿中。
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单核细胞贴壁培养

在 37°C、5% CO₂的培养箱中培养 24 小时，使单核细胞贴壁。
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诱导培养

1、在无菌锥形管中，制备含 40-50ng/mL M-CSF(abs04696)的 RPMI1640 完全培养基。可选：加入 20ng/mL 的 IL-4(UA040026)

2、用含 M-CSF 和 IL-4 的培养基替换培养皿中的培养基。

3、在 37°C、5% CO₂的培养箱中培养细胞 6 天。在这 6 天内，每隔 3-4 天，补充含 40-50ng/mL M-CSF(abs04696)的 RPMI1640 完全培养基（可选：加入 20ng/mL 的 IL-4）。用显微镜检查细胞健康和生长密度。
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细胞收集与清洗

1、当细胞质中出现很多颗粒，且细胞略有伸长时，就可以收集细胞。此外，大量的细胞应贴附于培养板上。当收集细胞时，丢弃旧培养基，用 1×PBS 冲洗培养皿两次，每次冲洗后都丢弃 PBS。

2、向每个培养皿加入 10mL 10mM EDTA，在室温静置 10 分钟或直到细胞不再贴附于培养皿。

3、将细胞收集在 50mL 锥形管中，在室温下 300-400×g 离心 4-5 分钟。

4、丢弃上清液，并用 1×PBS 冲洗细胞。300-400×g 离心 4-5 分钟。

5、丢弃上清液，用流式染色缓冲液（abs9475）基重悬细胞。