研究思路：获取高纯度、高活性线粒体（细胞/组织来源），用于后续功能、蛋白、核酸、代谢物检测。全程冰上/4℃操作，控制在1小时内完成，避免破裂和失活。
实验步骤
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样品预处理
1、细胞：预冷PBS洗2次，4℃ 1000g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀（1×10⁷cells）。
2、组织：新鲜组织（肝/脑/肌肉）剪碎至1mm³，预冷PBS洗去血污。
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匀浆裂解
1、细胞：加5mL预冷线粒体裂解缓冲液（250mM蔗糖、10mM Tris-HCl pH7.4、1mM EDTA、1mM PMSF、1×蛋白酶抑制剂），冰浴10min，玻璃匀浆器（Teflon杵）匀浆10–15次（镜检：80%细胞破碎，无完整细胞核）。
2、 组织：加10mL裂解缓冲液，匀浆20–30次（冰上操作，避免产热）。
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差速离心纯化
步骤
离心力
时间
温度
目的
低速
600g
10min
4℃
弃沉淀（细胞核/未破碎细胞）
中速
1500g
10min
4℃
弃沉淀（大膜碎片）
高速
12000g
15min
4℃
沉淀为粗线粒体，上清为胞浆蛋白
洗涤
12000g
10min
4℃
重复2次，去除杂质
重悬保存：沉淀用储存缓冲液（250mM蔗糖、10mM Tris-HCl pH7.4、0.1mM EDTA）重悬，浓度1–5mg/mL，-80℃分装保存（活性维持1个月）。
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纯度/活性验证
1、纯度：Western Blot检测标志物——外膜TOM20、内膜COXIV、基质HSP60（阳性）；胞浆GAPDH、细胞核Histone H3（无杂带）。
2、活性：JC-1检测膜电位（正常线粒体红色荧光，损伤绿色）；呼吸控制率（RCR）≥3为高活性。