2.1 实验流程

1、细胞接种：共聚焦小皿（35mm），密度50–70%，贴壁24h。

2、探针配置：

a) MitoScene Green I：膜电位非依赖，标记所有线粒体（形态计数）。

b) MitoTracker Red CMXRos：膜电位依赖，标记健康线粒体（活性评估）。

c) 工作液：200nM（无血清培养基稀释），母液1mM（DMSO溶解）。

3、染色：弃培养基，加2mL工作液，37℃避光孵育20min。

4、洗涤：预冷PBS洗3次（每次5min），加1μg/mL的Hoechst 33342染核10min。

5、成像：共聚焦显微镜，激发/发射：Green（490/525nm）、Red（579/599nm）、Hoechst（361/497nm）。

6、分析：ImageJ软件统计线粒体长度、数量、分支度、网络密度。

1、固定：4%多聚甲醛（PFA）室温15min，PBS洗3次。

2、透化：2% Triton X-100室温10min，PBS洗3次。

3、封闭：5% BSA室温1h。

4、一抗（4℃过夜）：

a) TOM20、COXIV（参照抗体说明书推荐稀释比）

b) MFN2、DRP1（参照抗体说明书推荐稀释比）

5、二抗：适配一抗种属，带荧光素标记，室温避光1h。

6、染核：Hoechst 33342（10min），抗荧光淬灭封片剂封片。

7、成像分析：共聚焦显微镜，分析蛋白共定位、线粒体融合/分裂比例。

1、固定：5%戊二醛，4℃固定2h；1%锇酸固定1h。

2、脱水：梯度乙醇（50%→70%→90%→100%）各10min，丙酮过渡10min。

3、包埋：环氧树脂，60℃聚合24h。

4、切片：超薄切片（70nm），醋酸铀-柠檬酸铅双重染色。

5、观察：透射电镜JEOL JEM-1400，评估嵴排列、膜完整性、基质密度、自噬体包裹线粒体。