3.1 线粒体呼吸功能与ATP生成

1、细胞接种：XF96专用板（Agilent 101085-004），2×10⁴cells/孔，贴壁24h（80%融合）。

2、探针/缓冲液准备：

a）XF培养基：DMEM（无酚红）+10mM葡萄糖+2mM谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠，pH7.4，37℃预热。

b）抑制剂：寡霉素（Oligomycin）：2μM，抑制ATP合酶（复合体V）；FCCP：1μM，解偶联剂，最大化呼吸；鱼藤酮/抗霉素A（Rotenone/Antimycin A）：0.5μM，抑制复合体I/III。

3、细胞预处理：弃培养基，加180μL XF培养基，37℃无CO₂孵育1h。

4、上机检测：Seahorse XF96分析仪，37℃，检测周期：

a）基线：3次（每次3min）。

b）注射1：寡霉素，检测3次。

c）注射2：FCCP，检测3次。

d）注射3：鱼藤酮/抗霉素A，检测3次。

5、数据分析：计算关键参数

a）基础呼吸 = 基线OCR – 抗霉素A后OCR

b）ATP生成 = 基线OCR – 寡霉素后OCR

c）最大呼吸 = FCCP后OCR – 抗霉素A后OCR

d）备用呼吸 = 最大呼吸 – 基础呼吸

类别	名称	货号	用途
试剂	Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent 103015-100
	无酚红DMEM	abs9276	培养基
	寡霉素	abs42024304	抑制ATP合酶
	FCCP	abs816229	解偶联剂
	鱼藤酮	abs811985	抑制复合物I/III
	抗霉素A	abs47045979	抑制复合物I/III
耗材	Seahorse XF96细胞培养板	Agilent 101085-004
仪器	Seahorse XF96分析仪	Agilent
	CO₂培养箱、无CO₂孵育箱	Thermo

 

为确保功能数据与分子机制相互印证，同步还可采用呼吸链复合物 I–V 核心抗体进行 Western Blot 验证，从蛋白表达水平解释呼吸功能异常的分子基础，实现 “功能表型 — 分子机制” 的完整闭环

类别	名称	货号	说明
试剂	NDUFS1 (E4K3E) Rabbit Monoclonal Antibody	70264	复合物 I
	SDHB (E3H9Z) Rabbit Monoclonal Antibody	92649	复合物 II
	UQCRC2 (F8Y5N) Rabbit Monoclonal Antibody	99258	复合物 III
	COX IV (3E11) Rabbit Monoclonal Antibody	4850	复合物 IV
	ATP5A1 Antibody	18023	复合物 V

 

通过上述呼吸链复合物抗体检测，可明确呼吸功能下降是由于复合物表达降低、组装异常、还是功能抑制，使 Seahorse 功能数据更具说服力，满足高分文章与课题评审要求。