4.1 线粒体自噬

1、细胞处理：6孔板/共聚焦小皿，转染Parkin质粒（或内源性Parkin细胞），CCCP（10μM，诱导线粒体损伤/自噬）处理2h，对照组DMSO。

2、固定/透化/封闭：4% PFA固定15min→0.2% Triton X-100透化10min→5% BSA封闭1h。

3、一抗孵育：

a）线粒体：TOM20。

b）自噬体：LC3B。

c）溶酶体：LAMP1。

d）4℃孵育过夜。

4、二抗孵育：Alexa Fluor 488、594、647，室温避光1h。

5、成像：共聚焦显微镜，分析TOM20与LC3B共定位（自噬体包裹线粒体）、TOM20与LAMP1共定位（线粒体-溶酶体融合）。

1、蛋白提取：细胞/组织，RIPA裂解液（含PMSF/蛋白酶抑制剂）提取总蛋白，BCA定量。

2、电泳/转膜：10% SDS-PAGE电泳→转PVDF膜→5%脱脂奶封闭1h。

3、一抗：PINK1、Parkin、LC3B、p62（自噬底物）、TOM20、GAPDH，4℃孵育过夜。

4、二抗：HRP标记二抗，室温1h，ECL发光，检测PINK1/Parkin活化、LC3-II/LC3-I比值、p62降解。

1、细胞接种：96孔板，密度5×10³ cells/孔，转染Parkin质粒，37℃培养24h。

2、染色：Mtphagy工作液（0.1μM，Dojindo），37℃孵育30min，PBS洗2次，加CCCP（10μM）处理2h。

3、检测：荧光显微镜/流式细胞仪，红色荧光（完整线粒体）、绿色荧光（自噬线粒体），定量自噬通量。