研究思路:线粒体蛋白折叠异常时,激活UPRmt(转录因子ATF4/CHOP、分子伴侣HSP60/HSP10、蛋白酶LONP1),恢复稳态,检测标志物表达、转录水平、通路活化。
实验步骤
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实验流程
1、模型构建:细胞用线粒体应激诱导剂(如2μM寡霉素、5μM鱼藤酮)处理6h,对照组DMSO。
2、RNA提取:Triizol提取总RNA,反转录为cDNA,qRT-PCR检测HSP60、HSP10、LONP1、ATF4、CHOP mRNA水平(GAPDH为内参)。
3、蛋白检测:Western Blot检测上述蛋白表达,免疫荧光检测HSP60(线粒体)与ATF4(细胞核)共定位。