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4.4 线粒体未折叠蛋白反应

4.3 线粒体代谢与生物合成 | 4.5 线粒体衍生囊泡

研究思路:线粒体蛋白折叠异常时,激活UPRmt(转录因子ATF4/CHOP、分子伴侣HSP60/HSP10、蛋白酶LONP1),恢复稳态,检测标志物表达、转录水平、通路活化。

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 1

    实验流程

    1、模型构建:细胞用线粒体应激诱导剂(如2μM寡霉素、5μM鱼藤酮)处理6h,对照组DMSO。

    2、RNA提取:Triizol提取总RNA,反转录为cDNA,qRT-PCR检测HSP60、HSP10、LONP1、ATF4、CHOP mRNA水平(GAPDH为内参)。

    3、蛋白检测:Western Blot检测上述蛋白表达,免疫荧光检测HSP60(线粒体)与ATF4(细胞核)共定位。

  • 2

    所需试剂、耗材、仪器(扩充)

    类别

    名称

    货号

    用途

    试剂

    寡霉素

    abs42024304

    抑制ATP合酶

    鱼藤酮

    abs811985

    抑制复合物I/III

    Triizol

    abs60154

    RNA提取

    一步法RT-qPCR试剂盒

    abs60310

    mRNA水平检测

    HSP60抗体

    abs158264

    WB/IHC检测

    HSP10抗体

    abs159304

    WB检测

    LONP1抗体

    abs179493

    WB检测

    ATF4抗体

    abs145695

    WB/IHC检测

    CHOP抗体

    abs158466

    WB检测

    GAPDH

    abs132004

    内参基因