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1.3.2 MACS细胞分选步骤

1.3.1 MACS细胞分选实验前准备 | 1.4 NK细胞Protocol 常见分选问题

分选步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 1

    PBMC预处理

    a)细胞计数:用MACS缓冲液重悬PBMC至适当体积(每10 mL全血约需1 mL缓冲液)。
    b)离心洗涤:将细胞转移至15 mL离心管,加MACS缓冲液至14 mL
    c)离心:540×g,5 min,4°C
    d)弃上清,轻弹管底松散细胞。
  • 2

    磁珠标记

    a)细胞重悬:按每1×10⁷细胞加40 µL MACS缓冲液(如1.5×10⁷细胞加60 µL)。
    b)抗体孵育:每1×10⁷细胞加10 µL NK细胞Biotin抗体混合物(靶向非NK细胞,如CD3/CD19/CD14等)。混匀,4°C孵育5 min。
    c)微珠结合:
         每1×10⁷细胞加30 µL MACS缓冲液稀释。
         每1×10⁷细胞加20 µL NK细胞MicroBead混合物(结合非NK细胞)。
         混匀,4°C孵育10 min。
  • 3

    磁柱分选

    a)柱准备:将MACS柱(MS/LS)置于磁架中,预分离滤器置于柱上。用MACS缓冲液冲洗:
        MS柱:500 µL
        LS柱:3 mL
    弃废液,更换新收集管。
    b)上样:将标记的细胞悬液通过滤器上样至柱中(最小体积500 µL)。用缓冲液冲洗:
        MS柱:500 µL ×3次
        LS柱:3 mL ×3次
        未标记的NK细胞收集于15 mL管中。
  • 4

    细胞回收

    a)离心浓缩:收集的流穿液离心(540×g,5 min,4°C)。弃上清,用MACS缓冲液重悬(500–1000 µL)。
    b)细胞计数:取10 µL细胞悬液 + 90 µL Türk’s溶液,计数NK细胞。
    c)关键注意事项
        低温操作:全程保持4°C(减少非特异性结合)。
        柱容量:
           MS柱:≤1×10⁷ PBMC
           LS柱:≤1×10⁸ PBMC
  • 5

    流式检测

    用CD56抗体验证NK细胞纯度(预期>90%)。

  • 6

    功能实验

    刺激后检测IFN-γ分泌