分选步骤
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PBMC预处理
a)细胞计数:用MACS缓冲液重悬PBMC至适当体积(每10 mL全血约需1 mL缓冲液)。b)离心洗涤:将细胞转移至15 mL离心管,加MACS缓冲液至14 mL。c)离心:540×g,5 min,4°C。d)弃上清,轻弹管底松散细胞。磁珠标记
a)细胞重悬:按每1×10⁷细胞加40 µL MACS缓冲液(如1.5×10⁷细胞加60 µL)。b)抗体孵育:每1×10⁷细胞加10 µL NK细胞Biotin抗体混合物(靶向非NK细胞,如CD3/CD19/CD14等)。混匀,4°C孵育5 min。c)微珠结合:每1×10⁷细胞加30 µL MACS缓冲液稀释。每1×10⁷细胞加20 µL NK细胞MicroBead混合物(结合非NK细胞)。混匀,4°C孵育10 min。磁柱分选
a)柱准备:将MACS柱(MS/LS)置于磁架中,预分离滤器置于柱上。用MACS缓冲液冲洗:MS柱:500 µLLS柱:3 mL弃废液,更换新收集管。b)上样:将标记的细胞悬液通过滤器上样至柱中(最小体积500 µL)。用缓冲液冲洗:MS柱:500 µL ×3次LS柱:3 mL ×3次未标记的NK细胞收集于15 mL管中。细胞回收
a)离心浓缩:收集的流穿液离心(540×g,5 min,4°C)。弃上清,用MACS缓冲液重悬(500–1000 µL)。b)细胞计数:取10 µL细胞悬液 + 90 µL Türk’s溶液,计数NK细胞。c)关键注意事项低温操作:全程保持4°C(减少非特异性结合)。柱容量:MS柱:≤1×10⁷ PBMCLS柱:≤1×10⁸ PBMC流式检测
用CD56抗体验证NK细胞纯度(预期>90%)。
功能实验
刺激后检测IFN-γ分泌