1.3.2 MACS细胞分选步骤

1.3.1 MACS细胞分选实验前准备 | 1.4 NK细胞Protocol 常见分选问题

分选步骤

1

PBMC预处理

a）细胞计数：用MACS缓冲液重悬PBMC至适当体积（每10 mL全血约需1 mL缓冲液）。

b）离心洗涤：将细胞转移至15 mL离心管，加MACS缓冲液至14 mL。

c）离心：540×g，5 min，4°C。

d）弃上清，轻弹管底松散细胞。
2

磁珠标记

a）细胞重悬：按每1×10⁷细胞加40 µL MACS缓冲液（如1.5×10⁷细胞加60 µL）。

b）抗体孵育：每1×10⁷细胞加10 µL NK细胞Biotin抗体混合物（靶向非NK细胞，如CD3/CD19/CD14等）。混匀，4°C孵育5 min。

c）微珠结合：

每1×10⁷细胞加30 µL MACS缓冲液稀释。

每1×10⁷细胞加20 µL NK细胞MicroBead混合物（结合非NK细胞）。

混匀，4°C孵育10 min。
3

磁柱分选

a）柱准备：将MACS柱（MS/LS）置于磁架中，预分离滤器置于柱上。用MACS缓冲液冲洗：

MS柱：500 µL

LS柱：3 mL

弃废液，更换新收集管。

b）上样：将标记的细胞悬液通过滤器上样至柱中（最小体积500 µL）。用缓冲液冲洗：

MS柱：500 µL ×3次

LS柱：3 mL ×3次

未标记的NK细胞收集于15 mL管中。
4

细胞回收

a）离心浓缩：收集的流穿液离心（540×g，5 min，4°C）。弃上清，用MACS缓冲液重悬（500–1000 µL）。

b）细胞计数：取10 µL细胞悬液 + 90 µL Türk’s溶液，计数NK细胞。

c）关键注意事项

低温操作：全程保持4°C（减少非特异性结合）。

柱容量：

MS柱：≤1×10⁷ PBMC

LS柱：≤1×10⁸ PBMC
5

流式检测

用CD56抗体验证NK细胞纯度（预期>90%）。
6

功能实验

刺激后检测IFN-γ分泌