1.1 样本制备及MACS分选protocol

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1、准备细胞并计数

2、细胞悬液300g离心10min，完全弃去上清

3、每10⁸个细胞用400μl缓冲液重悬

4、每10⁸个细胞加入100μl的生物素标记的抗体

5、完全混匀，2-8℃孵育5min

6、每10⁸个细胞加入200μl缓冲液

7、每10⁸个细胞加入200μl抗生物素标记的磁珠

8、每10⁸个细胞加入100μl的CD44磁珠

9、完全混匀，2-8℃孵育10min

10、（可选）为了得到最高的回收率，每10⁸个细胞加入1-2ml缓冲液洗涤并300g离心10min；完全弃去上清，每10⁸个细胞用500μl缓冲液重悬

11、开始磁性分选

注意：一直等待到柱子空后在进行下一步

注意：选择LS柱子和合适的MACS分离器

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1、准备细胞并计数，LS柱子放置在合适的MACS分离器的磁场中；

2、3ml缓冲液冲洗柱子

3、将细胞悬液放置在柱子上；收集流出的未标记的细胞（富集的naive CD4⁺T细胞）

4、3ml缓冲液清洗柱子，收集流出的未标记的细胞（富集的naive CD4⁺T细胞），与步骤3收集的细胞混合在一起

注意：如果需要用流式分析新分选的naive CD4⁺T细胞，细胞数量要达到10⁶

5、从分离器中取出柱子，将其置于合适的收集管中。取5ml缓冲液放在柱子上。用力将柱塞推入柱内冲出带有磁性标记的非naive CD4⁺T细胞