实验步骤
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实验思路框架
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实验目的 建立小鼠初始（naive）CD4⁺ T细胞的体外分化体系，研究不同细胞因子组合对T细胞亚型分化的调控机制，具体包括：
● Th1（抗胞内病原体，促自身免疫炎症）
● Th2（促B细胞应答，参与过敏）
● Th17（促自身免疫炎症）
样本来源 5-10周龄雌性C57BL/6小鼠
脾脏 + 淋巴结（腘窝、腹股沟、腋窝、臂部、浅表颈部、下颌、肠系膜淋巴结）样本处理 分选-扩增培养-诱导极化-流式鉴定-细胞因子功能检测 实验难度评估 必须去除nTreg（CD25⁺）和记忆T细胞（CD44⁺），避免干扰分化
需预实验滴定抗体/因子浓度，Th17需高抗CD3浓度
全程冰上操作，缓冲液含1% FBS
分选后需过滤去除碎片，培养时严格无菌操作 -
所需试剂/耗材产品清单
类别 产品名称 规格/浓度 应用步骤 供应商/货号参考 抗体
（T细胞刺激）抗CD3（2C11） 0.5–5 μg/ml（板包被） T细胞激活 Starter#S0B0509 抗CD28（37.51） 0.25–2.5 μg/ml（板包被） 共刺激信号 Starter#S0B1142 中和抗体
（细胞因子阻断）抗IL-4（11B11） 5–10 μg/ml Th1/Th17/iTreg极化阻断 Starter#S0B0839 抗IFNγ（XMG1.2） 5–10 μg/ml Th2/iTreg极化阻断 Starter#S0B0956 细胞因子 rmIL-4 5–30 ng/ml Th2极化 UA#UA040192 rmIL-6 5–30 ng/ml Th17极化 UA#UA040155 rmIL-12 10–30 ng/ml Th1极化 UA#UA040218 hTGFβ1 0.1–30 ng/ml（亚型依赖） iTreg/Th17极化 UA#UA040172 hIL-2 5–50 U/ml 扩增支持（除Th17外） UA#UA040171 耗材 尼龙滤网 70、100umμm孔径，灭菌 组织过滤 Absin#Abs7232/abs7233 细胞培养板 24孔/48孔 极化培养 Corning #3524/#3548 缓冲液 ACK裂解缓冲液 1×，冰上使用 脾脏红细胞裂解 Absin#Abs9101 FACS缓冲液 PBS + 1% BSA + 1mM EDTA 流式分选标记 自制 细胞分选设备 细胞分选仪 - Naive T细胞分选 BD FACSAria III 磁珠分选系统 autoMACS CD4⁺细胞富集 Miltenyi #130-090-451