3.2.2 Mouse Naive CD4⁺ T细胞分选

1、动物准备​：5-10周龄C57BL/6雌鼠（雄鼠脂肪多，操作难度高），经安乐死并消毒体表。

2、解剖取组织​：

    ● 淋巴结​：腘窝、腹股沟、腋窝、臂部、浅表颈部、下颌、肠系膜淋巴结（见图1定位）。

    ● 脾脏​：腹腔左侧肋骨下缘取出。

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3、将组织制备为单细胞悬液​：

    ● 淋巴结：置于含PBS+1%FBS的皿中，120μm尼龙网覆盖，注射器活塞轻压粉碎。

    ● 脾脏：同法粉碎后需 ​裂解红细胞​（1ml ACK缓冲液/脾，冰上1分钟，立即用10ml PBS+1%FBS终止）

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    ● ​磁珠标记​：细胞悬液加CD4磁珠（15μl/鼠），4℃孵育15-30分钟。

    ● ​阳性分选​：用autoMACS或其他磁珠分选系统分离CD4⁺细胞，缓冲液为PBS+1%FBS。

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1、抗体标记​：CD4-APC（1:200）、CD25-PE（1:100）、CD62L-FITC（1:200）、CD44-PerCP（1:100），

2、4℃避光30分钟。

3、收集标准​：CD4⁺CD25⁻CD62L⁺CD44⁻（见下图分选门控）。

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4、调整浓度​：PBS+1%FBS重悬至1×10⁶ cells/ml。