实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
-
培养板预处理
包被抗体（4℃过夜或37℃ 1小时）：
亚型 抗CD3浓度 抗CD28浓度 Th1/Th2 1 μg/ml 1 μg/ml Th17 2 μg/ml 1 μg/ml 洗涤：PBS洗3次去除未结合抗体
-
极化培养
接种细胞：48孔板每孔0.5×10⁶细胞（0.5ml RPMI完全培养基）。
极化因子添加
亚型 关键因子 阻断抗体 Th1 IL-12 (15ng/ml) + IL-2 (30U/ml) 抗IL-4 (11B11, 5μg/ml) Th2 IL-4 (10ng/ml) + IL-2 (30U/ml) 抗IFNγ (XMG1.2, 5μg/ml) + 可溶性抗CD28 Th17 TGFβ (3ng/ml) + IL-6 (20ng/ml) 抗IFNγ + 抗IL-4 (各5μg/ml) -
扩增（48小时换液）
1、移除原培养基：吸弃含TCR刺激因子的培养基。
2、重悬扩增：Th1/Th2/iTreg：新鲜RPMI + 10U/ml IL-2（浓度降至初始1/3）。
3、Th17：无需IL-2（避免抑制Th17分化）。
继续培养：37℃ 5% CO₂培养至第4-5天。
-
分化结果验证（见下图示例）
流式检测：PMA/离子霉素激活4-6小时，检测胞内细胞因子
Th1：IFNγ⁺
Th2：IL-4⁺
Th17：IL-17⁺（需同时检测Foxp3排除iTreg污染）
△点击放大图片
ELISA：细胞洗涤后，抗CD3（1μg/ml）再刺激24小时，取上清检测。
-
关键注意事项
1、Th17特异性：
需更高抗CD3包被浓度（2μg/ml）
避免添加IL-2（抑制Th17分化）
2、Th2增强：可溶性抗CD28显著提升IL-4产量。
3、污染控制：分选时严格排除CD25⁺（Treg）与CD44⁺（记忆T细胞）。
4、时间窗口：极化培养4-5天为最佳分析点，过长导致细胞衰竭。