实验步骤
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实验思路框架
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实验目的 ● 建立小鼠初始CD4⁺ T细胞的体外Th17分化体系，探究IL-17在自身免疫疾病中的作用机制
● 验证IL-6/TGF-β信号通路对Th17/Treg分化平衡的调控作用
● 为自身免疫疾病（如多发性硬化症、类风湿性关节炎）提供体外研究模型样本来源 3-8月龄C57BL/6小鼠（Jackson Laboratory）
脾脏 + 淋巴结（腘窝、腹股沟、腋窝、臂部、浅表颈部、下颌、肠系膜淋巴结）样本处理 分选-扩增培养-诱导极化-流式鉴定-细胞因子功能检测 实验难度评估 ● CD25⁺ Treg残留会抑制Th17分化，需验证分选后CD4⁺CD25⁻纯度
● C57BL/6小鼠需5天分化，其他品系（如BALB/c）需优化时间
● 磁珠分选：autoMACS负选CD4⁺CD25⁻细胞，同步获得CD4⁺CD25⁺ Treg
● Th17极化：抗CD3/CD28激活 + IL-6(20ng/ml) + TGF-β(5ng/ml) -
所需试剂/耗材产品清单
类别 产品名称 规格/浓度 应用步骤 供应商/货号参考 T细胞刺激抗体 抗CD3(板包被) 10μg/ml T细胞激活 Starter#S0B0509 抗CD28 1.5μg/ml 共刺激信号 Starter#S0B1142 细胞因子 rmIL-6 20ng/ml Th17极化核心因子 UA#UA040155 hTGF-β1 5ng/ml Th17极化核心因子 UA#UA040172 磁珠分选试剂 CD4⁺CD25⁺ Treg分离试剂盒 - CD4⁺CD25⁻分选 Miltenyi #130-093-627 autoMACS Running Buffer - 分选缓冲液 Miltenyi #130-091-221 检测试剂 抗IL-17A（流式） - 胞内染色 BD Biosciences #560820 IL-17A ELISA配对抗体 TC11-18H10/TC11-8H4-biotin 蛋白定量 BD #555068/#555067 耗材 40μm尼龙滤网 3×3英寸 细胞过滤 毛面玻片 - 组织研磨 Fisher Scientific #12-544-7 96孔U底培养板 - Th17极化 Corning #3799