实验步骤
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培养板预处理
抗CD3包被：96孔U底板，10μg/ml抗CD3，37℃包被4小时
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Th17极化培养
细胞接种：CD4⁺CD25⁻细胞（1×10⁵ cells/well）
培养基：RPMI+10% FBS+50μM β-巯基乙醇
极化因子：
组分 终浓度 抗CD28 1.5μg/ml rmIL-6 20ng/ml hTGF-β1 5ng/ml 培养时间：37℃ 5% CO₂培养5天（C57BL/6品系）
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扩增换液
第3天半量换液：吸弃50%旧培养基，补充等量含IL-6/TGF-β的新鲜培养基
避免添加IL-2：抑制Th17分化
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分化验证
流式检测：PMA/离子霉素激活4小时 + BFA阻断分泌 → 抗IL-17A胞内染色
典型结果：Th17组IL-17A⁺比例＞30%（对照组＜5%）
qPCR：检测RORγt mRNA表达上调＞10倍
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关键注意事项
1、Treg污染防控：CD4⁺CD25⁻分选后残留CD25⁺细胞需＜2%，分选缓冲液需预温至37℃（避免冷激活）
2、Th17极化增强：使用U底板增强细胞-抗体接触；TGF-β批次差异大，需预实验滴定
3、品系差异：NOD/BALB/c小鼠需缩短分化时间至72小时，基因敲除鼠需增加细胞接种密度（1.5×10⁵ cells/well）