实验所需设备:  流式上样管，6孔细胞培养板，37℃孵箱，5％CO2。混匀振荡器，掌上离心机，水平转子离心机，流式细胞仪

实验所需试剂:  肝素钠抗凝的全血(BD 肝素钠抗凝管)，RPMI-1640，FBS，淋巴细胞分离液，普通PBS

MA/Ionomycin + BFA/Monensin

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PBMC的分离 
1. 4ml新鲜抗凝血，用人外周血淋巴细胞分离液分离出PBMC（参考分离液产品说明书）。 
2. 吸取PBMC细胞层。PBMC层在血浆下面。小心吸取，吸到15ml离心管中。 
3. RPMI 1640洗涤一次。加RPMI 1640至8ml体积，颠倒混匀，离心， 20℃，250g，10min。  
4. 弃上清，重悬细胞到3 ml RPMI 1640（含10%FBS）。细胞计数。备用。 

PBMC刺激 
5. 取出6孔板，做好标记（未刺激孔，刺激孔），每孔加入1mlPBMC, 再分别加入1ml RPMI1640（10%FBS）,混匀，避免产生气泡。
6. 刺激孔加入刺激剂（550583）4ul，用枪吹打混匀,尽量避免产生气泡。
7. 放入37℃，5%CO2培养箱培养5h。
8. 5小时后，收细胞，350g，离心，5 minutes，弃上清。
9. 刺激5小时后，收细胞，同时加入1ml RPMI1640冲洗细胞培养板，一起收集到离心管中，350g，离心，5 minutes，弃上清。
10. 分别加入2ml stainbuffer中，离心，350g，5 minutes。
11. 弃上清，分别重悬细胞到1mlstainbuffer/管。

阻断，表面染色 
12. 分别按照未刺激组和刺激组分管，每管100ul细胞悬液。
13. 每管中分别加入2.5 ug 的Human Fc阻断剂，混匀并室温孵育10min。
14. 分别加入相应的表面标记抗体，混匀后，室温避光孵育15min。
15. 每管中加入2ml 的stain buffer重悬细胞，350g离心5min.

固定破膜  胞内染色 
16.用100ul PermWashBuffer重悬固定破膜后的细胞，按照管设置对应加入IL-4，IFN-r，室温避光孵育20min。
17. 用stain buffer洗细胞两次。350g离心5 minutes，弃上清。
18.用0.3ml StainBuffer重悬固定染色后的细胞，上机检测分析。

 

Human 外周血Th1/Th2/Th17胞内流式检测案例流式图:

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Flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) using the Human Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kit.
The staining pattern of IFN-γ, IL-17A and IL-4 on resting PBMC (left column), PMA/Ionomycin stimulated PBMC (middle column) and polarized Th17 cells (right column) are shown. The top three panels show the staining of IL-17A vs. IFN-γ and the bottom three panels show the staining of IL-17A vs. IL-4. Dot plot analyses are derived from gated CD4+ cell populations. Flow cytometry was performed on a BD™LSR II 

Mouse脾脏 Th1/Th2/Th17胞内流式检测案例流式图:

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Flow cytometric analysis of Mouse Th1/Th2/Th17 phenotyping kit. The staining pattern of IFN-g, IL-17A and IL-4 on resting spleen cells(left column), PMA/Ionomycin stimulated spleen cells (middle column) and polarized Th17 cells (right column) are shown. The top three panels show the staining of IL-17A vs. IFN-γ and bottom three panels show the staining of IL-17A vs IL-4. Th17 cells were generated from mouse spleen cells for a 14 days period under polarizing condition described by Chen Dong et al (see references below). Dead cells appear on the diagonal. Dot plot analyses are derived from gated CD4+ cell populations. Flow cytometry was performed on a BD FACSCalibur™.System.