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2.2.4 石蜡切片(FFPE样本)

| 2.3.1 全血样本

视频素材来源于YouTube  https://www.youtube.com/watch?v=t8jJtM04jho
版权归原作者所有

 

FFPE样本的前处理过程中,福尔马林固定使得组织中的DNA之间、DNA与蛋白质、RNA等发生随机交联并使得DNA降解,石蜡包埋过程又加速了DNA降解,给下游的PCR及高通量测序带来很大挑战。

 

该流程按照QIAGENQIAamp DNA FFPE Tissue Kit(货号:56404)流程为例,此试剂盒中不包含脱蜡成分,可单独购买QIAGEN Deparaffinization Solution(19093)或选择完整试剂盒(56604)。

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 7
  • 8
  • 9
  • 10
  • 11
  • 12
  • 13
  • 14
  • 15
  • 16
  • 1

    切除多余石蜡

    用解剖刀将样本块多余的石蜡切除;

  • 2

    切片

    85–10μm厚的样本;(如果样本外围暴露于空气,可以丢弃开始的2—3片);

  • 3

    加入脱蜡液

    把切好的样本立刻置于1.52ml离心管中,并加入1ml脱蜡液(货号:19093)。盖上管盖于振荡器上剧烈震荡10s;

  • 4

    离心

    最大转速室温离心2分钟;去上清,切勿碰到沉淀;

  • 5

    加入乙醇

    加入1ml 96–100%乙醇于沉淀,振荡混匀;(乙醇抽提样本中残余的二甲苯),最大转速室温离心2分钟;去上清,切勿碰到沉淀;(用小枪头小心去除残余乙醇);

  • 6

    孵育

    打开管盖室温(15–25°C)或37°C孵育10分钟,直到残留的酒精蒸发干净;

  • 7

    加入试剂,混匀震荡

    180μl Buffer ATL重悬沉淀,加入20μl proteinase K,振荡混匀;

  • 8

    孵育

    56°C孵育1小时,直到样本完全裂解;90°C孵育1小时;(在Buffer ATL90°C孵育会部分逆转核酸的甲醛修饰,过长的孵育时间或过高的孵育温度都会导致更多的DNA断裂。如果只有一个水浴装置,在56°C孵育完后请置于室温,等到水浴升到90°C再开始孵育);

  • 9

    短暂离心

    短暂离心,去除1.5ml离心管管盖内壁的液滴;

  • 10

    加入Buffer和乙醇

    200ul Buffer AL到样品中,振荡器上彻底混匀,然后加入2ml 96–100%乙醇,再次用振荡器彻底混匀;短暂离心,去除1.5ml离心管管盖内壁的液滴;

  • 11

    弃除装有流液的收集管

    QIAamp MinElute column放置在2ml收集管中,在不打湿边缘的情况下,将全部裂解液小心转移到QIAamp MinElute column,盖上管盖,6000xg(8000rpm)离心1分钟,将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml收集管中,弃除装有流液的收集管;

  • 12

    加入Buffer AW1,并离心

    小心打开QIAamp MinElute column,在不打湿边缘的情况下,加入500ul Buffer AW1,盖上管盖,6000xg(8000rpm)离心1分钟,将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml离心管中,弃除装有流液的收集管;

  • 13

    加入Buffer AW2,并离心

    小心打开QIAamp MinElute column,在不打湿边缘的情况下,加入500ul Buffer AW2。盖上管盖,6000xg(8000rpm)离心1分钟,将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml离心管中,弃除装有流液的收集管;

  • 14

    离心

    全速20,000xg(14,000rpm)离心3分钟以彻底干燥QIAamp MinElute column中的膜;

  • 15

    加入Buffer ATE

    QIAamp MinElute column置于一个干净的1.5ml离心管内,弃除装有流液的收集管。小心打开QIAamp MinElute column的管盖,往膜中央加入20–100μl Buffer ATE;

  • 16

    得到纯化后的DNA

    盖上管盖,室温(15–25°C)放置1分钟,全速20,000xg(14,000rpm)离心1分钟。得到纯化后的DNA。

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