扩增目的片段，使用高保真的PCR酶，如下操作步骤由产品abs60034高保真聚合酶Xerox试剂盒为例：
实验步骤
- 1
- 2
- 3
-
PCR扩增体系
实际操作中应该首先计算需补加水的体积，先加水，然后按下表中所列顺序添加其它成分。充分混匀后，离心数秒使反应混合物沉到管底，将反应管置于PCR仪中进行扩增。
Component
25 µl Reaction
50 µl Reaction
Final conc.
Nuclease-FreeWater
Add to 25μl
Add to 50μl
2× Xerox PCR Master Mix
12.5μl
25μl
1×
10 µM Forward Primer
0.5-1μl
1-2μl
0.2-0.4μM
10 µM Reverse Primer
0.5-1μl
1-2μl
0.2-0.4μM
Template DNA
variable
variable
< 1,000ng
-
扩增模板
1、低复杂基因组模板(质粒、病毒、λ和BAC DNA等),50μl体系中添加5-10ng。为获得更高保真性的扩增产物，高浓度模板和少量PCR循环数组合是一个较好的方法；
2、高复杂基因组模板，50μl反应体系中，DNA模板的使用量应该在100-500ng，如果扩增的片段较长，最好用琼脂糖电泳检测DNA的完整性。DNA的完整性越好，长距离PCR的成功率越高；
3、cDNA模板的添加量不要超过PCR反应体系的1/10,50μl PCR反应体系中RT产物的加入量为2-3μl，不要超过5μl。
-
PCR循环设置
Cycle step
Temperature
Time
Cycles
Initial denaturation
98℃
1
Denaturation
Annealing
Extension98℃
50-72℃
72℃5-10sec
10-20sec
10-30sec/kb25-40
Final extension
72℃
4℃5 min
Hold1