如下操作步骤由产品abs60206快速内切酶BsaI为例：
实验步骤
- 1
- 2
- 3
-
DNA 快速酶切流程
1、在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：
质粒 DNA
PCR 产物
基因组 DNA
ddH2O
15 μl
16 μl
30 μl
10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer
2 μl
3 μl（a）
5 μl
底物 DNA
2 μl (up to 1 μg)
10 μl (~0.2 μg)
10 μl (5 μg)
BsaI
1 μl
1 μl
5 μl
Total
20 μl
30 μl
50 μl
a.本体系适用于经过纯化的PCR产物酶切。未纯化的PCR产物具备一定的离子强度，10×Cut Buffer加入量可适当减少至2μl。但由于DNA聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。
2、轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋)，然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
3、37℃温育15min(质粒)，或15~30min(PCR产物)，或30~60min(基因组DNA)；
4、80℃温育20min即可使酶失活，停止反应(可选)。
-
双酶切或多酶切
1、每种快速内切酶的用量为1μl，并根据需要适当扩大反应体系；
2、所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10；
3、如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。
-
适用于质粒的扩大反应体系
DNA
1 μg
2 μg
3μg
4 μg
5 μg
BsaI
1 μl
2μl
3 μl
4 μl
5 μl
10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer
2 μl
2 μl
3 μl
4 μl
5 μl
Total
20 μl
20 μl
30 μl
40 μl
50 μl
注：如果总反应体系大于20μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
不同DNA中的酶切位点数量：
NA
ΦX174
pBR322
pUC57
pUC18/19
SV40
M13mp18/19
Adeno2
2
0
1
1
1
0
1
0
甲基化修饰影响：
am
Dcm
CpG
EcoKI
EcoBI
无影响
序列完全重叠剪切阻断
序列完全重叠剪切阻断
无影响
序列可能重叠剪切阻断
在不同反应缓冲液中的活性：
Cut Buffer
Thermo Scientific
FastDigest BufferNEB
CutSmart®
BufferTakara
QuickCut™ Buffer活性
100%
100%
100%
50%
酶切结果图：
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