6.2 筛选

1、抗性平皿经37℃培养12小时(过夜)培养后，进行菌斑PCR鉴定；

 

2、挑取平板上面的5-10个单克隆，进行菌落PCR的鉴定；

 

3、准备两排PCR管子(或PCR板子)，一排配好菌落PCR的反应体系，一排放入配好的加了抗生素的培养基，用镊子或移液枪带上枪头挑取单克隆，在PCR体系的管子里面上下抖动，然后放入对应的培养基的管子里面，一一对应挑取单克隆，做好记号，含有培养基的管或板子放入恒温培养箱培养，含有PCR反应体系的管或板子放入PCR仪中反应；

 

4、设计菌落PCR的引物，其中一条为载体的通用引物，另一条为插入片段的特异性引物，建议扩增的序列长度是200bp左右，单克隆菌落PCR后跑胶查看结果；

 

5、选取扩增条带正确，亮度大的单克隆对应的PCR管或板子的菌液进行试管摇菌，后续提取质粒。

 

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1、通过重组质粒的图谱选择合适的内切酶，对重组质粒进行酶切验证；

 

2、在分析软件上通过模拟酶切得到酶切后的片段数和片段大小；

 

3、充分酶切后，通过跑胶确认条带数和大小是否正确；

 

酶切验证图：

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