实验步骤
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DNA模板制备
可参考上述的质粒构建流程。制备模板质粒必须使用dam+大肠杆菌菌株，例如DH5α菌株。
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引物设计
推荐使用安捷伦引物设计网站
网址：https://www.agilent.com.cn/store/primerDesignProgram.jsp
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设计好的引物序列，可外送公司进行引物合成。
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突变反应
以安捷伦QuikChange lightning Site-Directed突变试剂盒为例(货号：210518&210519)。
试剂盒组成如下：
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试剂盒组成如下：培养基和试剂制备
LB Agar (每升)
10 g NaCl
10 g tryptone
5 g 酵母提取物
20 g 琼脂糖
加入去离子化的水，使最终体积为1升
调节pH值到7
高温灭菌
倒入培养皿 (~25 ml/100-mm 培养皿)
LB–Ampicillin Agar （每升）
1升LB Agar高压灭菌
冷却至55°C
加入100毫克过滤消毒的ampicillin
倒入培养皿（~25ml/100mm培养皿）
NZY+ Broth （没升）
10 gNZ amine（酪蛋白水解物）
5 g酵母提取五
5 gNaCl
添加去离子水至最终体积1升
调整pH 至7.5
高温灭菌
在使用前添加以下经过过滤和消毒的补充剂：
12.5 ml 1 M MgCl2
12.5 ml 1M MgSO4
20 ml 20%（w/v）葡萄糖（或10 ml 2M葡萄糖）
TE 缓冲液
10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
1 mM EDTA
具体步骤如下：
1、准备对照体系，具体如下：
5 μl 10× reaction buffer
5 μl (25 ng) pWhitescript 4.5-kb control plasmid (5 ng/μl )
1.25 μl (125 ng) 对照引物 #1
1.25 μl (125 ng) 对照引物 #2
1 μl of dNTP mix
1.5 μl of QuikSolution reagent
34μl ddH2O
最终体系为50μl
之后添加1μl QuikChange Lightning 酶
2、制备反应体系，具体如下
5 μl 10× reaction buffer
X μl (10–100 ng) of dsDNA template
X μl (125 ng) 引物 #1
X μl (125 ng) 引物 #2
1 μl dNTP mix
1.5 μl of QuikSolution reagent
添加ddH2O 使最终体积50 μl
之后添加1μl QuikChange Lightning 酶
注：在保持引物浓度不变的情况下，使用10~100ng(如10、25、50和100 ng的dsDNA模板）建立一系列梯度样品反应。
进行PCR反应，温度和循环数如下：
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Dpn I 酶消化
1.在每个扩增反应中直接添加2µl所提供的Dpn I限制性内切酶；
2.轻轻吹打，混匀反应混合物，短暂地旋转反应混合物，然后立即在37°C下孵育5分钟，以消化亲本(即未突变的)的dsDNA。
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转化感受态
1.在冰上解冻XL10-Gold感受态细胞。针对每个对照和样品反应的，分别将45µl的感受态细胞加入到预冷的14ml BD Falcon聚丙烯圆底管中；
2.将试剂盒提供的2µlβ-ME混合物加入到45µl的感受态细胞中；
3.轻轻地旋转，将细胞放在冰上培养2分钟；
4.加入2µl经Dpn I处理的DNA；
(可选：将1µl 0.01ng/µl pUC18对照质粒（稀释1：10）加入到45µl的细胞中，验证XL10-Gold感受态细胞的转化效率)
5.轻轻旋转，混合并在冰上孵育30分钟；
6.在42°C水浴中预热NZY+ Broth(见培养基和试剂的制备)，用于第9步；
7.在42°C水浴中热激30秒。热激持续时间是获得最高效率的关键。不得超过42°C；
8.在冰上孵育2分钟；
9.加入0.5ml预热(42°C)NZY+肉汤，在37°C下以225-250rpm振荡1小时；
10.将每个转化反应的适当体积放在含有针对质粒载体的适当抗生素的琼脂培养皿上，如下表所示：
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将转化后感受态细胞均匀的涂在含有80µg/mlX-gal和20 mM IPTG的LB–ampicillin平板上；
11.将转化板在37°C下孵育>16小时。
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测序验证
挑选克隆，可送公司进行一代测序验证。
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实验小Tips
1、引物设计
(1)通常突变引物长度为25~45bp, 一般都是以要突变的碱基为中心, 各加上两边的一段序列, 两边长度至少为10–15bp，同时合成反向互补的引物。可以使用超过45个碱基的引物，但使用较长的引物会增加二级结构形成的可能性，这可能会影响诱变反应的效率；
(2)设计引物时最好将突变引物设在目的基因的中央位置；
(3)引物Tm值至少达到78℃。估算引物Tm的常用公式如下：
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) − (675/N) − % mismatch
注：
N为%GC的碱基值中的引物长度
%错配为整数
若需要计算引入插入或删除的引物的Tm，请使用上述公式的修改版本：
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) − (675/N)
注：N不包括正在插入或删除的碱基数量
(4)上下游突变引物都必须包含所需的突变，并在质粒的相反链上退火到相同的序列；
(5)引物的GC含量应为40%，并终止于一个或多个C或G碱基；
(6)引物不需要5‘磷酸化；
(7)对于典型的突变引物，通过脱盐进行纯化通常就足够了。对于长时间或复杂的诱变引物，可以通过液相色谱（HPLC/FPLC）或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化，可显著提高诱变效率。
2、突变效率
(1)必须使用试剂盒搭配的Dpn I酶进行未突变DNA模板；
(2)使用试剂盒配套的β-ME，若使用其他来源的β-ME可能会降低转换效率。