样本制备-高通量测序技术

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5.1 样本制备

| 6.1.1 DNA建库

我们针对样本制备，可以提取来源于各种原料（细胞、组织、骨头、血液、石蜡切片、cfDNA，脑脊液、肺泡灌洗液、土壤、水体、空气....）的DNA、RNA（miRNA）、蛋白质。

如下操作步骤以产品货号56404的FFPE样本DNA为例，产品列表详见右下方推荐产品

实验步骤

1

开始前的要点

· 注意：在室温 (15–25°C) 下执行所有离心步骤。

· 将所有缓冲液平衡至室温 (15–25°C)。

· 将恒温箱或恒温培养箱设置为 56°C，以便在步骤 12 中使用。如果没有恒温箱或恒温培养箱，可以使用加热块或水浴代替。

· 如果 Buffer AL 或 Buffer ATL 含有沉淀物，加热至 70°C 并轻轻搅拌溶解。

· 确保缓冲液 AW1 和缓冲液 AW2 已准备好。
2

使用手术刀，从样品块上修剪掉多余的石蜡
3

最多切割 8 个 5–10 µm 厚的切片

如果样品表面暴露在空气中，丢弃前 2-3 个切片。
4

立即将切片放入 1.5 或 2 ml 微量离心管中，并向样品中加入 1 ml 二甲苯。盖上盖子并大力涡旋 10 秒

立即将切片放入1.5或2ml微量离心管中，并向样品中加入1ml二甲苯。盖上盖子并大力涡旋10秒。
5

在室温 (15–25°C) 下全速离心 2 分钟
6

通过移液去除上清液。

通过移液去除上清液，不要移除任何颗粒
7

向沉淀中加入 1 ml 乙醇 (96–100%)，涡旋混合。

乙醇从样品中提取残留的二甲苯
8

在室温下全速离心 2 分钟
9

通过移液去除上清液

不要去除任何颗粒。使用细吸管尖端小心地去除任何残留的乙醇
10

打开试管并在室温或最高 37°C 下孵育

孵育10分钟或直到所有残留的乙醇蒸发。
11

在 180 µl Buffer ATL 中重悬沉淀

加入20µl 蛋白酶K，涡旋混合。
12

在56°C 孵育 1 小时（或直至样品完全溶解）。
13

在 90°C 下孵育 1 小时

在Buffer ATL中于90°C孵育可部分逆转核酸的甲醛修饰。较长的孵育时间或较高的孵育温度可能会导致更多的DNA片段化。如果仅使用一个加热块，则在56°C孵育后将样品置于室温，直到加热块达到90°C。
14

将 1.5 ml 试管短暂离心以去除盖子内侧的液滴

如果需要不含RNA的基因组DNA，加入2µl RNase A(100 mg/ml) 并在室温下孵育2分钟，然后继续步骤14。在加入RNase A之前让样品冷却至室温
15

向样品中加入 200 µl Buffer AL，并通过涡旋彻底混合。然后加入 200 µl 乙醇 (96–100%)，通过涡旋再次彻底混合。

样品、缓冲液AL和乙醇必须立即通过涡旋或移液器彻底混合以产生均质溶液。缓冲液AL和乙醇可以在一个步骤中预先混合并一起添加，以在处理多个样品时节省时间。

加入Buffer AL和乙醇后可能会形成白色沉淀。这种沉淀不会干扰 QIAamp 程序。
16

将 1.5 ml 试管短暂离心以去除盖子内侧的液滴。
17

将整个裂解物转移到 QIAamp MinElute 柱（在 2 ml 收集管中）

小心地将整个裂解物转移到QIAamp MinElute柱（在2ml收集管中），不要弄湿边缘，盖上盖子，以6000xg(8000rpm) 离心1分钟。将QIAamp MinElute 柱放入干净的2ml收集管中，并丢弃含有流出液的收集管。

如果离心后裂解物没有完全通过膜，请再次以更高的速度离心，直到QIAamp MinElute柱为空。
18

加入 500 µl Buffer AW1

小心打开QIAamp MinElute 柱，加入500µl Buffer AW1，不要弄湿边缘。关闭盖子并以6000xg(8000rpm) 离心1分钟。将QIAamp MinElute 柱放入干净的2ml收集管中，并丢弃含有流出液的收集管。
19

加入 500 µl Buffer AW2

小心打开QIAamp MinElute 柱，加入500µl Buffer AW2，不要弄湿边缘。关闭盖子并以6000xg(8000rpm) 离心 1 分钟。将QIAamp MinElute 柱放入干净的2ml收集管中，并丢弃含有流出液的收集管。

应避免QIAamp MinElute 柱与流通液接触。某些离心机转子可能会在减速时振动，导致含有乙醇的流通液与QIAamp MinElute 柱接触。从转子上取下QIAamp MinElute 色谱柱和收集管时要小心，以免流出液与QIAamp MinElute 色谱柱接触。
20

全速（20,000 xg；14,000 rpm）离心 3 分钟以完全干燥膜

这一步是必要的，因为乙醇进入洗脱液可能会干扰一些下游应用。
21

将 QIAamp MinElute 柱放入干净的 1.5 ml 微量离心管中

将QIAamp MinElute 柱放入干净的1.5ml微量离心管中，并丢弃含有流出液的收集管。小心打开QIAamp MinElute 柱的盖子，将20–100µl Buffer ATE 涂抹在膜的中心。
重要提示：确保Buffer ATE平衡至室温。如果使用小洗脱体积（<50 µl），请将Buffer ATE 分配到膜的中心，以确保完全洗脱结合的DNA。

QIAamp MinElute 柱在选择洗脱体积方面提供了灵活性。根据下游应用的需求选择一个volume。洗脱液的体积将比施加到柱子上的洗脱液体积少5 µl。
22

盖上盖子，在室温下孵育 1 分钟。全速（20,000 x g；14,000 rpm）离心 1 分钟

离心前将装有Buffer ATE的QIAamp MinElute 柱在室温下孵育5分钟，通常会增加DNA产量。

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