注意：使用条形码适配器时，一次打开一个适配器管并在移取不同的条形码适配器之间更换手套，以避免交叉污染。

表 1. PCR 产物接头连接试剂

* 我们建议通过微流体或毛细管电泳平台对 PCR 产物进行定量。如果使用其他供应商的适配器，请将适配器添加到 1 µM 最终浓度，并按照供应商的说明进行操作。

通过上下移液几次来混合组分。

将热循环仪编程为在 25°C 下孵育 30 分钟。视情况其他反应可以在室温下孵育。
重要提示：请勿使用带加热盖的热循环仪。

反应完成后，将反应物置于冰上并使用 Agencourt AMPure XP 珠进行纯化。

为每个连接反应准备 1.5 ml LoBind 管并标记试管或准备 96 孔板（具体选择哪个取决于磁架的可用性和个人喜好）。

将步骤 4 中的 50 µl 连接反应液转移到准备好的 1.5 ml LoBind 管或 96 孔板中，并加入 50 µl 无核酸酶水。

对于长度不超过 350 bp 的 PCR 产物：
向每个连接反应中加入 40 µl（0.4 倍体积）Agencourt AMPure XP 微珠，通过移液器充分混合，然后继续执行步骤 8。

对于大小为 350–1000 bp 的 PCR 产物：
在每个连接反应中加入 60 µl（0.6 倍体积）Agencourt AMPure XP 微珠，通过移液器充分混合，然后继续执行步骤 12（跳过步骤 8-11）。

在室温下孵育混合物 5 分钟。将磁珠放在磁性支架（例如 DynaMag）上 5 分钟。

为每个连接反应准备一个新的 LoBind 管或一个新的 96 孔板。

小心地将 133 µl 上清液转移到新管中，不要干扰磁珠。这将留下大约 7 µl 上清液。丢弃含有不需要的大 DNA 片段的珠子。大DNA 片段是通过接头与非特异性多重 PCR 产物的连接产生的。
注意：不要丢弃上清液。

将 40 µl 重悬的 Agencourt AMPure XP Beads 浆液添加到上清液中，并通过移液器充分混合。

在室温下孵育混合物 5 分钟。

脉冲旋转管或板。将磁珠放在磁性支架上（例如 DynaMag）5 分钟，然后小心地取出并丢弃上清液。小心不要丢弃珠子，因为它们包含文库。
注意：不要丢弃珠子。

加入 200 µl 80% 乙醇清洗磁珠。将磁珠放在磁力架上，弃去上清液。重复洗涤一次，总共进行 2 次乙醇洗涤。

尽量在不干扰珠子的情况下去除残留的乙醇。在磁力架上孵育珠子 5-10 分钟或直到珠子干燥。珠子过度干燥可能会导致 DNA 回收率降低。然后从磁性支架上取下。

通过重悬于 26 µl 无核酸酶水中进行洗脱。通过移液充分混合并在室温下孵育管或板 2 分钟以从珠子中洗脱 DNA。

将管或板放回磁架上以使珠子沉淀。孵育直到液体澄清。

在文库扩增过程中使用 23.5 µl 洗脱液，如果输入的扩增子数量足够，则直接进行定量和测序。

表 2. DNA 文库扩增的循环条件

* 注：循环数取决于输入扩增子的数量和质量。一般来说，4 个循环足以处理 20-500 ng 的 PCR 输入产物，10 个循环足以处理 1-20 ng 的 PCR 产物输入。如果输入 DNA 足够（>500 ng），则可以省略文库扩增。

表 3. PCR 扩增反应组分

将 PCR 板转移到热循环仪并启动程序。

PCR 完成后，将 50 µl 重悬的 Agencourt AMPure XP Beads 添加到每个反应 (50 µl) 中，并上下吸管彻底混合珠子和 PCR 混合物。

在室温下孵育混合物 5 分钟。将磁珠放在磁性支架（例如 DynaMag）上，小心丢弃上清液。

加入 200 µl 80% 乙醇清洗磁珠。将磁珠放在磁力架上，弃去上清液。重复洗涤一次，总共两次乙醇洗涤。从磁性支架上取下。

在磁力架上孵育 5-10 分钟，直到珠子变干。珠子过度干燥可能会导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

通过重悬于 30 µl 无核酸酶水中进行洗脱。通过移液充分混合。将磁珠放在磁力架上。小心地将 28 µl 上清液转移至干净的 LoBind1.5 ml 试管或 PCR 板。

使用毛细管电泳设备或类似方法评估库的质量。检查文库片段的预期大小分布，是否缺少接头、扩增引物、接头二聚体或高分子量过度扩增伪影。
注意：库应显示反映输入 PCR 扩增子大小加上 120 bp 的分布。文库长度的增加反映了向 PCR 扩增子添加了测序接头。中值片段大小可用于后续基于 qPCR 的量化方法来计算文库浓度。

使用 GeneRead Library Quant Kit（货号 180612）或类似方法对文库进行量化。

纯化的文库可以安全地储存在 –20°C 的 DNA LoBind 管中，直到准备好进行测序。

使用高质量、无伪影的 PCR 产品时； QIAseq 1-Step Amplicon 文库通常不含接头二聚体、文库扩增引物、过量接头和高分子量扩增产物。当为输入量选择合适的循环数时，纯化后的文库产量应约为 5 nM，并且体积应足以在大多数 NGS 平台上进行质量控制、文库量化和测序。

在示例实验中，如图图3所示， 参考 DNA 使用 GeneRead DNAseq V2 Human Comprehensive Cancer Panel（06/2015 版）扩增。该面板由 4 个独立的 PCR 反应组成，每个反应包括 1988 对引物。扩增子旨在捕获 160 个癌症相关基因，包括大约 745 kb 的基因组。 PCR 后，汇集产物并分析产量和长度分布（图 3).

图 3. 混合多重 PCR 扩增子的电泳图谱。在扩增和汇集后，可以看到一个预期大小 (160 bp) 的峰值，它代表这组 PCR 引物的平均扩增子大小。以 35 bp 为中心的第二个大峰由电泳标记、未延伸的引物和延伸的引物二聚体组成。在纯化过程中，这些较短的产物被去除，只留下所需的 PCR 扩增子。

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PCR 产物根据 GeneRead DNAseq Targeted Panels V2 手册使用 Agencourt AMPure XP Beads 进行纯化，并使用 25 ng 使用 QIAseq 1-Step Amplicon Library Kit 生成文库。文库通过 4 个循环的 PCR 扩增，纯化后共产生 28 µl 5 nM 文库（图4， 显示 1:10 稀释）。虽然测序质量、读取长度和获得的读取数量会因测序平台而异，但使用 QIAGEN GeneRead DNAseq Library Quant Array 等文库量化方法可以实现更准确的聚类，优化数据产量和质量。

使用 QIAseq 1-Step Amplicon Library Kit 生成的典型数据包含由接头二聚体产生的最少读数，当与高质量 panel 配对时，通常具有 >95% 的目标读数，在目标扩增子上读数分布均匀。

图 4. 使用 QIAseq 1-Step Amplicon Library Kit 制备的纯化文库的电泳图谱。由于接头添加的附加序列，观察到 120 bp 的特征大小变化。典型的文库应不含由过量引物、接头或接头二聚体和高分子量峰组成的较短峰，这些峰可由基因组引入或通过对完整库进行过度扩增

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